Zpracování materiálu
pro mikroskopické vyšetření
Jaroslava Dušková
Ústav patologie 1. LF UK, Praha
Fixace & zalití do parafinu
Krájení
Barvení
Montování preparátu
Tkáňové vzorky
Nátěry, cytocentrifugace
Fixace (formalin, glutaraldehyd,
vyschnutí, mražení)
Barvení
Montování
Cytologické vzorky
Polychrome - Papanicolaou
F
N
A
B
Proč barvíme preparáty ?
⚫pro zviditelnění struktur
(empirická barviva pochází z textilního
průmyslu)
⚫k průkazu určitého materiálu
(např. Fe biochemická reakce –
histochemie)
⚫zviditelnění mikroorganismů
(bakterioskopie, mykózy, parasiti )
HE
Feulgen
May-Grünwald-Giemsa MGG
van Gieson - Elastica
Modrý trichrom
Olejová červeň
Kongo červeň
Haemochromatosis
myocardii
Fe
HE
PAS
Candida – Ag Impregnation
Candida – PAS
Candidiasis
Ziehl- Nielsen (BK)
Auramine-Rhodamine
Helicobacter pylori (Warthin – Stary impregnation)
Klüver- Barrera (Nissl + luxol blue)
Imunohistochemie
⚫ detekce antigenu použitím protilátky
(komerčně dostupné)
⚫ protilátka reaguje s antigenem a
⚫ reakce je visualizována (většinou
enzymatickým systémem , v němž produkt je
barevný, např. diaminobenzidinem DAB) –
hnědý reakční produkt
Progesteronové
receptory –
nenádorová tkáň
Ca mammae c-erbB2
Morfologické diagnostické metody
Patologické
makroskopie
mikroskopie
ultrastruktura
IMAGING – zobrazování
Morfometrická vyšetření
⚫ objektivizace & zpřesnění
diagnostických postupů
⚫staging (např. maligní melanom)
⚫grading (např. karcinom ledviny)
Genetické vyšetření
Označování preparátů
pro izolaci DNA pro jednotlivé prediktivní analýzy EGFR,
RAS, BRAF (mimo NGS)
Zvážit vhodnost vzorku pro testování:
optimálně >200 nádorových buněk v řezu (na izolaci 7 řezů) a ≥ 40 % nádorových buněk
min. 250 nádorových buněk celkem a min. ≥ 10 % nádorových buněk.
Na žádanku uvést jednu z variant:
1) celé (bez disekce) /NEBO/ makrodisekce (označit na HE) /NEBO/ mikrodisekce
2) % nádorových buněk
3) v případě limitních vzorků a cytologických nátěrů + počet nádorových buněk v řezu
Pozn1: Není-li dostatečný materiál pro analýzu, lze doporučit v případě EGFR analýzu z
cfDNA, tedy z tzv. tekuté biopsie.
Pozn2: Z našich plicních biopsií izolujeme od konce listopadu 2021 zároveň DNA/RNA a
uvádíme v poznámce pod výsledkem EGFR, zda-li máme dostatek DNA/RNA pro
případnou komplexní analýzu NGS.
Označování preparátů
pro izolaci DNA/RNA pro NGS analýzy (BRCA, komplexní
NGS panely)
Zvážit vhodnost vzorku pro testování:
optimálně: ≥ 2 000 nádorových buněk celkem a ≥ 50 % (min ≥ 40 %) nádorových buněk
Min.: 1000 nádorových buněk celkem) u < 40% (min 20 %) jsme schopni udělat
mutační analýzu, ale nikoli stanovit TMB a CNV) – u limitních vzorků vhodná
individuální porada s Hojný, Hájková nebo Stružinská.
Pozn1. případy s limitovaným počtem buněk, min. 1000 např. z laserová mikrodisekce
Pozn2. TMB lze počítat obvykle v případě ≥ 40 % nádorových buněk.
Na žádanku vždy uvést:
1) počet nádorových buněk v řezu, případně v makrodisekované či mikrodisekované
označené části
2) % nádorových buněk
Makrodisekce
oblasti pro makrodisekci označit jednoznačně, jednoduchými čarami
Laserová mikrodisekce
1. Výběr nádorové populace
2. Nastavení laseru (dle typu tkáně, dle její
tvrdosti)
3. Výřez pod větším zvětšením
4. Přenesení vyříznuté tkáně (sběr jednotlivých
výřezů) umístěné na speciální platformě na
adhezivní víčko mikrozkumavky
5. Izolace DNA, proteinů, RNA…