Máte zapnutý náhled celé osnovy, zpět na běžné zobrazení.
Načítání a prohlížení osnovy může být v závislosti na množství obsahu pomalejší.
Genetika
Anotace předmětu:
Předmět je koncipován jako teoretický. Studenti se seznámí se základními principy genetiky, dědičnosti na úrovni molekul, buněk a organismů s důrazem na lidskou genetiku. Součástí předmětu jsou informace o genealogických a cytologických vyšetřeních.
Kapitoly:
Kapitola obsahuje:
1
Text
Kapitola obsahuje:
1
Obrázek
1
Odpovědník
4
Text
Kapitola obsahuje:
1
Odpovědník
5
Text
Kapitola obsahuje:
3
Obrázek
1
Odpovědník
6
Text
Kapitola obsahuje:
1
Odpovědník
4
Text
Kapitola obsahuje:
1
Obrázek
1
Odpovědník
3
Text
Kapitola obsahuje:
9
Obrázek
1
Odpovědník
5
Text
Kapitola obsahuje:
3
Obrázek
1
Odpovědník
4
Text
Kapitola obsahuje:
1
Odpovědník
1 Úvod - Genetika
Když Johan Gregor Mendel před smrtí prohlásil "můj čas přijde", nikdo netušil kolosální hloubku pravdy, kterou jeho slova obsahovaly. Po téměř 130 letech od jeho smrti (+1884) má však vědní obor, u zrodu kterého stál, pro lidskou společnost zásadní význam. Ten obor se jmenuje genetika. Přinesl nejen teoretické poznatky o dědičnosti a proměnlivosti organismů, ale díky průniku s ostatními vědními obory, především s biochemií, mikrobiologií, fyzikou, fyzikální chemií, biologií a biostatistikou byl přetransformován do nejdynamičtěji se rozvíjejícího vědního odvětví biologických disciplín.
Nové poznatky na úrovni biomakromolekul přinesly možnost aktivního ovlivňování genetické informace živých soustav, tedy mikroorganismů, rostlin i živočichů. To vyústilo do enormního rozvoje biotechnologií, který je poháněn nejen touhou po vědeckém pokroku, ale také přirozenou snahou o zisk, která je do určité míry pozitivním katalyzátorem rozvoje. Dnes běžně mluvíme o rekombinantních vakcínách, synteticky vyráběných hormonech, inzulínu, atd. Jedná se o technologie, které byly ještě před půlstoletím nepředstavitelné.
Je jistým paradoxem, že negativa těchto technologií jsou citlivě vnímána nejen ze strany lidskoprávních organizací, ale v podstatné míře i církvemi. Johan Gregor Mendel, augustiánský mnich a opat kláštera na Starém Brně, stál u zrodu vědeckého proudu, který výrazně napomohl rozvoji umělých reprodukčních technik, genetického screeningu predispozice na rizikové onemocnění a prenatálního screeningu vrozených vývojových vad.
V současnosti existuje velký počet kvalitních, obsáhlých a srozumitelných učebnic a encyklopedií genetiky a jejích hraničních disciplín. Úkolem předkládané studijní opory není být jednou z nich, ačkoli byly cenným pramenem poznatků, které jsou v ní uvedeny. Primárním cílem textu je uvést studenta do genetiky, jejích principů a pravidel s důrazem na lidskou genetiku. Ve výkladovém textu postupuje podle logické posloupnosti nejdůležitějších lidských otázek: Co to je? Na jakém principu to existuje? Nač to je? Jak to lze využít?
Doufáme, že tato opora bude cennou pomocí pro studenty při objevování tohoto zajímavého vědního oboru, který ještě nevydal všechna svá tajemství. Přejeme studentům hodně úspěchů a elánu při studiu.
2 Genetická informace
2.4 Testovací otázky
Genetika je vědní obor, který studuje dědičnost a proměnlivost organismů. Dědičnost bývá nejčastěji definována jako schopnost organismů a jejich potomstva reagovat na stejné podmínky podobným způsobem. Proměnlivost je naproti tomu schopnost organismů lišit se od příbuzných jedinců téhož druhu.
Tento zdánlivý paradox je přirozený všem biologickým systémům. Jsou to totiž systémy živé a dynamické. Jako takové jsou nuceny reprodukovat se, protože jedinci nejsou nesmrtelní a vyznačují se biologickou životností, ohraničenou časovým intervalem. Proto musí mít zabezpečené reprodukční mechanismy, kterými zajistí svou kontinuitu v čase. Pokud se např. z mořského dna vynoří sopka a vytvoří nový ostrov, ten může "být" neměnný tisíc let. Na to, aby "byl" druh Homo sapiens na světě stejné časové období, potřebuje nepřerušovaný sled několika desítek generací.
S tvorbou biologických kopií to však není jednoduché. Živé soustavy na to používají chemické struktury, které se nazývají bioinformační makromolekuly. Při jejich funkci se může stát, že dojde ke vzniku a fixaci chyby v genetické informaci. Tehdy mluvíme o mutacích. Vzhledem k různorodosti vnějších podmínek se ukázalo, že různorodost (variabilita) je spíše prospěšná a napomáhá prožití druhu jako celku, ačkoli její existence z pohledu jednotlivce nemusí být vždy výhodná.
2.1 Chromosomy
Genetická informace člověka je organizována podobně jako u jiných mnohobuněčných eukaryontních organismů. V jádru jeho buněk (kromě výjimek, jako např. erytrocytů, které nemají jádro) se nacházejí chromozomy. Jsou to struktury tvořené nukleovými kyselinami (především DNA) a bílkovinami. DNA (kyselina deoxyribonukleotidová) je díky své jedinečné struktuře nositelem genetické informace. Úloha proteinů však není méně významná. Mají podpůrnou, ochrannou a regulační funkci, přičemž hrají aktivní roli ve všech dějích, spojených s přenosem a / nebo zpracováním genetické informace. Z chromozomálních bílkovin jsou známé především histony.
Jak vzniká chromozom, který lze vidět pod mikroskopem? Vinutím dvoušroubovice DNA kolem oktaméru histonů, který je tvořen typy H2A, H2B, H3 a H4 a napojením této struktury na histon H1 vzniká základní stavební jednotka chromatinu - nukleozom. Jeho průměr je přibližně 10 nm. Další spiralizací vzniká solenoid, který je tvořen nejméně pěti nukleozomy. Postupnou spiralizací se tvoří struktury vyšších řádů, až nakonec vznikne pozorovatelný útvar v jádru- chromozom.
Buňka člověka v jádru obsahuje 23 párů chromozomů. Dohromady je to tedy 46 chromozomů. Z nich je 22 párů tzv. autozomů, které se nazývají i somatické, nepohlavní chromozomy. Poslední 23. pár chromozomů tvoří pohlavní chromozomy X a Y. Nazývají se gonozomy. Systém uspořádání chromozomů souvisí s rozmnožováním člověka. Jedinec dostane od každého ze svých rodičů 23 chromozomů, dohromady tedy 46. Proto má pro každý chromozom přítomny dvě jeho kopie, které tvoří tzv. homologický chromosomový pár.
Jádro však není jediné místo, kde se nachází genetická informace ve formě DNA. Mitochondrie taky nesou svou vlastní genetickou informaci. Ta je však neúplná, takže pro svou funkci potřebují i makromolekuly, kódované na DNA v jádru. Pro tuto svoji částečnou "nezávislost" genetické informace se mitochondrie nazývají semiautonomní organely. U rostlin do stejné kategorie patří navíc i chloroplasty.
DNA je v mitochondriích přítomna ve více kopiích, přičemž její organizace je jiná, než jakou má DNA v jádru. Hlavní rozdíly jsou dva: mitochondriální DNA (dále mtDNA) má kružnicový tvar, kdežto jaderná DNA je lineární. mtDNA na rozdíl od jaderné DNA neobsahuje bílkoviny histonového typu.
Poruchy regulace počtu kopií DNA mohou představovat pro organismus problém. Snížený počet kopií DNA se nazývá deplece mtDNA a je spojen se skupinou poruch dýchacího řetězce. Kromě toho se v mtDNA mohou vyskytovat bodové mutace a přestavby.
Pro mitochondrie je příznačná taky matroklinita. Je to typ dědičnosti, při které je potomstvu předáván znak výhradně v podobě, v jaké se vyskytuje u matky.
2.2 Nukleové kyseliny
Mezi bioinformační makromolekuly, které nazýváme nukleové kyseliny, patří DNA a RNA. Název DNA je odvozen z anglického (deoxyribonucleic acid), protože obsahuje β -D-2-deoxyribosu. Je to cukr s pěti atomy uhlíku (cyklická furanosa).
Kromě pentosy zde nacházíme i dusíkaté báze. Jsou to heterocyklické sloučeniny, kde je heteroatomem dusík (obrázek 1). Jsou to deriváty purinu nebo pyrimidinu. V DNA se nacházejí dvě purinové báze - adenin a guanin. Pyrimidinové báze jsou tři - cytosin, thymin a uracyl.
Dusíkaté báze se vážou svým heteroatomem dusíku na C1' uhlík pentosy za vzniku N-glykosidické vazby. Pyrimidinové báze se vážou prostřednictvím dusíku N1, purinové bázi se vážou dusíkem N9. Spojením dusíkaté báze s pentosou prostřednictvím N-glykosidické vazby vzniká v případě DNA tzv. deoxyribonukleozid.
Vytvořením esterové vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a C5' atomem uhlíku pentosy v deoxyribonukleozidu vzniká deoxyribonukleotid-5'-monofosfát. Zbytek kyseliny fosforečné se může vázat další esterovou vazbou na C3' atom uhlíku jiného deoxyribonukleotidu. Vzniká tak 3 ', 5'-fosfodiesterická vazba, která spojuje uhlík C5' jednoho deoxyribonukleotidu s atomem C3' následujícího deoxyribonukleotidu (obrázek 1).
Biologickou funkci nosiče genetické informace má však až dvouřetězcová DNA (dále dsDNA). Její strukturu poprvé popsali v roce 1953 J. Watson, F. Crick a M. Wilkins (Nobelova cena za fyziologii a medicínu v roce 1962). Na objevu se výrazným způsobem podílela i Rosaline Franklin. dsDNA se skládá ze dvou polydeoxyribonukleotidových řetězců, které jsou spojeny vodíkovými vazbami. Ty vznikají vzájemným párováním dusíkatých bází tak, že adenin se dvěma vodíkovými vazbami spojí s thyminem a cytosin se třemi vodíkovými vazbami váže s guaninem (A=T; C≡G; viz obrázek 1).
Vzájemný poměr bázi, kterými se párují oba řetězce se řídí Chargaffovými pravidly:
- Molární obsah adeninu se rovná molárnímu obsahu thyminu:
A = T; T = A
- Molární obsah guaninu se rovná molárnímu obsahu cytosinu:
G = C; C = G
- Obecně je v každé dvoušroubovici DNA obsah molekul purinových bází rovný obsahu molekul pyrimidínových bází:
(A + G) = (C + T)
- Molární obsah adeninu se rovná molárnímu obsahu thyminu:
A = T; T = A
- Molární obsah guaninu se rovná molárnímu obsahu cytosinu:
G = C; C = G
- Obecně je v každé dvoušroubovici DNA obsah molekul purinových bází rovný obsahu molekul pyrimidínových bází:
(A + G) = (C + T)
Příklad: Sekvenci dvoušroubovice DNA tvoří 10 bází:
5´ – ATTAGCCATA – 3´
3´ – TAATCGGTAT – 5´
7 A = 7 T
3 C = 3 G
10 (C + T) = 10 (A + G)
Na uvedeném příkladu můžeme vidět tzv. komplementaritu obou řetězců DNA, která je daná párováním bází A-T a C-G. Důležitou vlastností dsDNA je antiparalelní orientace obou řetězců, z nichž je vytvořena. Můžeme totiž určovat tzv. orientaci řetězců, které na jednom konci končí deoxyribosou, na jejíž C5' uhlíku již není estericky vázán zbytek kyseliny fosforečné. Opačný konec je tvořen deoxyribosou, která má volnou OH skupinu na 3' uhlíku místo toho, aby byla esterická vazba s 5' uhlíkem deoxyribosy dalšího deoxyribonukleotidu (obrázek 1). Antiparalelní orientace je tedy stav, kdy se vzájemně spojí dva řetězce DNA s pomocí komplementárního párování bází, přičemž jejich směr je opačný. 5'- konec jednoho řetězce sousedí s 3' -koncem protějšího komplementárního řetězce a naopak.
U DNA známe několik úrovní strukturální organizace molekuly. Primární strukturou DNA se rozumí pořadí, čili sekvence deoxyribonukleotidů v řetězci DNA. Sekundární strukturou je samotná dvoušroubovice, tvořena dvěma antiparalelně orientovanými řetězci, které jsou spojeny vodíkovými vazbami. Ty vznikají při párování bází ve smyslu Chargaffových pravidel. Terciární struktura DNA vzniká při spiralizaci dsDNA, přičemž vzniká tzv. superhelix, čili nadšroubovice. Ta je důležitá v tvorbě struktur chromozomů během buněčného dělení. Enzymy v těchto dějích se nazývají topoisomerasy.
RNA je na rozdíl od DNA tvořena pouze jedním polyribonukleotidovým řetězcem. Druhým zásadním rozdílem je typ pentosy. RNA obsahuje β -D-ribosu, která má na C2' -uhlíku OH skupinu. Třetím rozdílem RNA od DNA je obsah uracylu místo thyminu. Rozdíly mezi oběma typy nukleových kyselin přehledně uvádí tabulka 1.
Tabulka 1/A Rozdíly ve složení nukleových kyselin
Typ nukleové kyseliny |
Stavební složky | ||
Pentosa |
Dusíkaté bázy |
Fosfodiesterická vazba | |
DNA |
β-D-2-deoxyribosa |
adenin, thymin, cytosin, guanin |
estericky vázaný zbytek H3PO4 |
RNA |
β -D-ribosa |
adenin, uracyl, cytosin, guanin |
estericky vázaný zbytek H3PO4 |
Známe několik typů RNA:
- mRNA (mediátorová RNA, angl. messenger RNA) přenáší informaci o pořadí aminokyselin z jádra buňky do cytoplasmy.
- rRNA (ribozomální RNA) je součástí struktury obou podjednotek, z nichž jsou tvořeny ribozomy. Podílí se na strukturální architektuře ribozomu a hraje důležitou roli v procesu syntézy bílkovin, tedy proteosyntéze.
- tRNA (transferová RNA) slouží pro přenos aktivovaných aminokyselin k ribozomům, na kterých se děje syntéza nového polypeptidového řetězce. tRNA je tvořena přibližně 70-80 ribonukleotidy. Přestože je tvořena jediným řetězcem RNA, jeho některé části obsahují vzájemně komplementární uspořádání bází. Důsledkem toho dochází k intramolekulárnímu párování bází, přičemž vzniká typická sekundární struktura, která svým vzhledem připomíná jetelový list. Jeho "listy" tvoří tři ramena: antikodonové, dihydrouridinové a pseudouridinové. Na opačném konci je tzv. akceptorové rameno.
Antikodonové rameno má důležitou roli při překladu genetické informace (genetického kódu) z pořadí nukleotidů v nukleových kyselinách do pořadí aminokyselin v polypeptidech během translace. Na akceptorovém rameni je navázána příslušná aktivovaná aminokyselina. Zvláštní název pseudouridinového a dihydrouridinového ramene je odvozen od obsahu atypických, tzv. minoritních bází pseudouridinu a dihydrouridinu.
Interakcemi mezi rameny, jejichž podstatou je především tvorba vodíkových můstků, vzniká terciární struktura RNA.
Obrázek 1 - Nukleové kyseliny
2.3 Koncepce genu
Gen je základní funkční jednotka dědičnosti, přičemž jeho materiální podstatou je specifická sekvence DNA nebo RNA, která nese ve své sekvenci nukleotidů informaci pro syntézu bílkoviny, nebo pro regulaci genetické informace.
Fyzické místo na chromozomu, na kterém se gen nachází, se nazývá lokus. Soubor všech genů organismu se nazývá genotyp. Výsledný projev genotypu jedince je však ve větší nebo menší míře ovlivňován vnějším prostředím. Mluvíme proto o fenotypu jedince.
3 Zpracování genetické informace
3.5 Testovací otázky
Nukleoproteinový systém, který se vyvinul pro uchovávání genetické informace, musí být značně stabilní, aby se zajistila stálost genetické informace. Na druhé straně však musí být schopen aktivní činnosti, spojené s přenosem genetické informace. V druhé polovině 20 století bylo definováno tzv. ústřední dogma molekulární biologie, které platí až dodnes. Podle něj je možný obousměrný přenos genetické informace v rámci nukleových kyselin (mezi DNA a RNA), ale pouze jednosměrný přenos genetické informace z nukleových kyselin na bílkoviny. Platí následující schéma:
DNA ↔ RNA → bílkoviny
O přenosu genetické informace v rámci nukleových kyselin mluvíme v případě replikace a transkripce (kapitoly 3.1 a 3.2). Přenos genetické informace z nukleových kyselin na bílkoviny se nazývá translace. Vzhledem k tomu, že se jedná o složité děje, v příslušných kapitolách jsou vysvětleny pouze do hloubky a rozsahu, požadovaného pro komplexní zvládnutí učiva genetiky. Pro zájemce o hlubší studium je na konci kapitoly uvedený seznam literatury.
PAOLELLA, P. Introduction to Molecular biology. Boston, USA: WCB/McGraw-Hill, 1998. 251s. ISBN 0-697-20939-3.
SRŠEŇ, Š., SRŠŇOVÁ, K. Základy klinickej genetiky a jej molekulárna podstata. Martin, SR: Osveta, 2005. 446 s. ISBN 80-8063-185-9.
ROSYPAL, S. Úvod do molekulární biologie. Díl I – Informační makromolekuly – Molekulární biologie prokaryot. 3. inovované vydání. Brno: S. Rosypal, 1999. 300s. ISBN 80-902562-0-1.
MELUŠ, V., KRAJČOVIČOVÁ, Z., SLOBODNÍKOVÁ, J. Genetika pre zdravotnícke odbory. Bratislava, SR: Samosato, 2011. 90 s. ISBN 978-80-89464-04-3.
3.1 Replikace
Dvoušroubovicová struktura DNA splňuje všechna kritéria, kladená na stabilní a spolehlivý molekulový nosič genetické informace. Jako taková tvoří základ chromosomů v jádře buňky. Buňka tvoří kopie DNA v průběhu S-fáze buněčného cyklu. Mechanismus tohoto děje je jedinečný a pro svůj princip se nazývá jako semikonzervativní replikace. Její podstatou je oddělení obou "starých" řetězců DNA, které tvoří původní dvoušroubovici, od sebe. V druhém kroku se podle pořadí bází v původních řetězcích nově tvoří - syntetizují nové řetězce DNA. Enzymy, které provádějí jejich syntézu, se nazývají DNA-polymerázy. Výsledkem je vznik dvou dvoušroubovic DNA, z nichž každá je tvořena jedním původním řetězcem DNA a druhým novým, který je k původnímu řetězci plně komplementární. Schematicky si můžeme tento proces ilustrovat na následujícím příkladu:
5´...ACTAGTTA...3´ 5´...ACTAGTTA...3´ původní
5´...ACTAGTTA...3´ 3´...TGATCAAT...5´ nový
3´...TGATCAAT...5´ ►► ►►
5´...ACTAGTTA...3´ nový
3´...TGATCAAT...5´ 3´...TGATCAAT...5´ původní
Celý proces má tři fáze: iniciaci, elongaci a terminaci.
Iniciace replikace zahajuje celý děj. S pomocí speciálních bílkovin, tzv. replikačních proteinů se rozplétá dvoušroubovice v přesně určeném místě, které se označuje zkratkou ori.
Elongace replikace zahrnuje syntézu nových řetězců DNA pomocí DNA-polymerázy. Tento enzym dokáže přidávat stavební jednotky řetězců DNA - deoxyribonukleotidy pouze na 3' konec řetězce DNA (obr. 1), který je tvořen OH-skupinou deoxyribózy na 3' uhlíku. Jinak řečeno, syntéza DNA je vždy jednosměrná a děje se pouze ve směru 5 '→ 3'. Oba původní řetězce jsou však protiběžné, antiparalelní. Jeden z řetězců má orientaci 5'-3 'a druhý 3'-5'. Proto i syntéza nových řetězců je sice časově shodná, ale principiálně odlišná. Jeden z nových řetězců se syntetizuje souvisle, zatímco druhý po krátkých částech, které se později spojí s pomocí jiného enzymu, zvaného DNA-ligáza. Řetězec DNA, který se syntetizuje souvisle, se nazývá vedoucí řetězec s orientací 5'-3 '. Druhý řetězec, který se syntetizuje za vzniku krátkých fragmentů má orientaci 3 '- 5' a nazývá se opožďující se řetězec. Krátké fragmenty, které jsou spojovány enzymem DNA-ligázu se nazývají Okazakiho fragmenty. Situaci vysvětluje následující příklad:
Původní sekvence dvou antiparalelnÍch řetězců, tvořících dvoušroubovici:
5´- ... ATTCGTATGCCTATATCGGGCAAGCGAGGTCCCAAGACACA ... – 3´
3´- ... TAAGCATACGGATATAGCCCGTTCGCTCCAGGGTTCTGTGT ... – 5´
V průběhu replikace se řetězce rozpletou a DNA polymeráza syntetizuje oba řetězce jedním směrem prostorově a zároveň ve směru 5 '- 3' současně pro oba řetězce:
5´- ... ATTCGTATGCCTATATCGGGCAAGCGAGGTCCCAAGACACA ... – 3´
3´- ... TAAG░ATACGGATAT░GCCCGTTCG◄◄◄◄◄GT– 5´ opožďující se řetězec
↑Okazakiho fragmenty ↑
►► DNA-POLYMERASA ►►
5´- ... ATTCGTATGCCTATATCGGGCAAGCGAG►►►► – 3´ vedoucí řetězec
3´- ... TAAGCATACGGATATAGCCCGTTCGCTCCAGGGTTCTGTGT ... – 5´
Terminace je závěrečná fáze replikace, ve které se působením terminačních proteinů celý proces ukončí. Výsledkem je vznik dvou dvoušroubovic DNA, z nichž každá má jeden původní řetězec DNA a jeden řetězec nový, který byl nasyntetizován a je komplementární k původnímu.
3.2 Transkripce
V průběhu transkripce se přepisuje pořadí (sekvence) nukleotidů v DNA do pořadí nukleotidů v RNA. Tím dochází k přenosu genetické informace z DNA na RNA. Ne všechny úseky na DNA se mohou přepisovat do RNA. Ty, které se přepisují, se nazývají transkripční jednotky. Některé jiné úseky se nepřepisují. Transkripční jednotka může obsahovat jeden nebo více strukturních genů. První nukleotid na DNA, od kterého začíná transkripce, se nazývá startovací nukleotid. Transkripce končí v místě zvaném terminátor. Před startovacím nukleotidem se nachází speciální sekvence několika nukleotidů, která se nazývá promotor. Na promotor se váže RNA-polymeráza, enzym, který syntetizuje RNA. Celý děj je regulován speciálními proteiny, tzv. transkripčními faktory. Mají regulační funkci a přímo interagují s RNA-polymerázou. Z obou řetězců dvoušroubovice DNA se v daném místě přepisuje do RNA většinou pouze jeden, který se nazývá kodogenní řetězec. Novosyntetizovaná RNA je jednořetězcová a její nukleotidová sekvence je komplementární k nukleotidové sekvenci kodogenního řetězce:
Původní dvoušroubovice DNA před transkripcí:
5´- ... ATTCGTATGCCTATATCGGGCAAGCGAGG ... – 3´
3´- ... TAAGCATACGGATATAGCCCGTTCGCTCC ... – 5´
Transkripce:
5´- ... ATTCGTATGCCTATATCGGGCAAGCGAGG ... – 3´
►► RNA-POLYMERASA ►►
5´- ... AUUCGUAUGCC – 3´ nová molekula RNA
3´- ... TAAGCATACGGATATAGCCCGTTCGCTCC ... – 5´ kodogenní řetězec
Vzniklá RNA není u člověka (a eukaryotních organismů obecně) způsobilá k okamžitému použití v procesech translace, jako je tomu např. u bakterií. Musí být zpracována tzv. posttranskripčními úpravami. V rámci nich se na 5'-konec RNA váže metylovaný guanin s pomocí 5 ', 5'-glykozidové vazby. Vzniká útvar zvaný čepička (angl. cap). Na 3' konec se přidává několik desítek adeninů v procesu tzv. polyadenylace. Části mRNA, které nenesou informaci o sekvenci aminokyselin ve struktuře bílkovin, jsou odstraněny. Nazývají se introny. Zbývající části se označují jako exony. Celý proces selektivního odstraňování specifických úseků RNA se nazývá sestřih (z angl. splicing). Nukleotidy v RNA podléhají chemickým modifikacím, nejčastěji methylaci.
3.3 Translace
Translace je děj, při kterém se překládá informace obsažená v nukleových kyselinách do sekvence aminokyselin při vytváření nových bílkovin - proteosyntéze. Děje se na ribozomech. Dříve, než bude vysvětlen postup translace, je nutno vysvětlit její princip. Organismus potřebuje obrovské množství různých bílkovin s různou strukturou, velikostí a funkcí. Všechny tyto bílkoviny však mají jednu věc společnou. Jsou složeny z aminokyselin, které jsou vzájemně spojeny peptidovou vazbou. Obrovská různorodost bílkovin, která je nezbytná z hlediska různých požadavků na jejich funkci, tvar a velikost, je zajištěna kombinováním dvaceti základních aminokyselin. Jejich pořadí tvoří tzv. primární strukturu bílkovin.
RNA je tvořena sekvencí pouze čtyř nukleotidů: adeninu, thyminu, cytozínu a uracylu. Proto není možné, aby každý nukleotid v sekvenci mRNA kódoval jednu aminokyselinu ve vznikající bílkovině. Každá aminokyselina je kódována trojicí nukleotidů, které jsou seřazeny za sebou. Proto můžeme definovat tzv. genetický kód: je to systém, kterým určuje pořadí nukleotidů v nukleových kyselinách pořadí aminokyselin v bílkovinách, čili v jejich polypeptidovém řetězci. Kombinace jednotlivých trojic nukleotidů, které kódují příslušné aminokyseliny, jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1/B Kombinace tripletů v mRNA a k nim příslušející aminokyseliny
Báze |
U |
C |
A |
G | ||||
U |
UUU |
fenylalanin |
UCU |
serin |
UAU |
tyrosin |
UGU |
cystein |
UUC |
fenylalanin |
UCC |
serin |
UAC |
tyrosin |
UGC |
cystein | |
UUA |
leucin |
UCA |
serin |
UAA |
stop |
UGA |
stop | |
UUG |
leucin |
UCG |
serin |
UAG |
stop |
UGG |
tryptofan | |
C |
CUU |
leucin |
CCU |
prolin |
CAU |
histidin |
CGU |
arginin |
CUC |
leucin |
CCC |
prolin |
CAC |
histidin |
CGC |
arginin | |
CUA |
leucin |
CCA |
prolin |
CAA |
glutamin |
CGA |
arginin | |
CUG |
leucin |
CCG |
prolin |
CAG |
glutamin |
CGG |
arginin | |
A |
AUU |
isoleucin |
ACU |
threonin |
AAU |
asparagin |
AGU |
serin |
AUC |
isoleucin |
ACC |
threonin |
AAC |
asparagin |
AGC |
serin | |
AUA |
isoleucin |
ACA |
threonin |
AAA |
lysin |
AGA |
arginin | |
AUG |
methionin |
ACG |
threonin |
AAG |
lysin |
AGG |
arginin | |
G |
GUU |
valin |
GCU |
alanin |
GAU |
kys. asparagová |
GGU |
glycin |
GUC |
valin |
GCC |
alanin |
GAC |
GGC |
glycin | ||
GUA |
valin |
GCA |
alanin |
GAA |
kys. glutamová |
GGA |
glycin | |
GUG |
valin |
GCG |
alanin |
GAG |
GGG |
glycin | ||
Při bližším prostudování tabulky 3.1 lze pochopit vlastnosti genetického kódu, který je:
Tripletový - každá aminokyselina je kódována trojicí nukleotidů v mRNA. Ne všechny trojice (označované také jako triplety nebo kodony) určují aminokyseliny. Tři kodony: UAA, UAG a UGA nekódují žádnou aminokyselinu. Nazývají se terminační kodony a mají roli při zakončení tvorby nové bílkoviny a svou polohou definují konec syntézy polypeptidové řetězce.
Degenerovaný - jedna aminokyselina může být kódována více kodony. Celkový počet kombinací trojic nukleotidů je 64, protože máme čtyři základní nukleotidy (A, C, G, U) z nichž vytváříme trojice. Matematicky vyjádřeno: 43 = 64. Proto například aminokyselina leucin je kódována triplety: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA a CUG. Šesti kombinacemi jsou kódovány i aminokyseliny serin a arginin. Čtyři různé kodony určují valin, prolin, threonin, alanin a glycin. Aminokysleina tryptofan je kódována pouze jediným triplety (UGG) a podobně je to iu aminokyseliny methionin (AUG). Význam degenerovanosti genetického kódu je vysvětlen v kapitole 5.
Nepřekrývající se - každý nukleotid v mRNA patří pouze do jednoho kodonu a nikdy není součástí jiného, vedlejšího kodonu.
Univerzální - genetický kód platí pro všechny živé soustavy téměř jednotně. Existují drobné odchylky u jednotlivých organismů z různých říší, nejsou však výrazné.
Lineární - kodony jsou seřazeny za sebou, lineárně. Podle jejich pořadí pak následují za sebou i aminokyselinové zbytky v nově syntetizovaném polypeptidovém řetězci.
Kromě tripletů, které rozhodují o pořadí aminokyselin v nové bílkovině, jsou pro translaci nezbytné i ribozomy, na kterých se děje. Ribozomy jsou nukleoproteinové struktury, složené ze dvou podjednotek. Jejich velikost je určována v jednotkách, které se označují jako Svedbergy (S). Malá podjednotka ribozomu má u člověka velikost 40S a kromě aminokyselin obsahuje i 18S rRNA. Velká ribozomální podjednotka má u člověka velikost 60S a obsahuje 5 rRNA, 5,8 rRNA a 28 rRNA. Mitochondrie člověka obsahují menší ribozomy, jaké nacházíme např. u prokaryotních organismů (bakterií). Zde je menší podjednotka ribozomu velká 30S a obsahuje 16S rRNA a větší podjednotka s velikostí 50S obsahuje 5S rRNA a 23S rRNA. Je zajímavé, že celková velikost ribozomu, který je složen z velké i malé podjednotky činí u člověka 80S a u prokaryot 70S.
Aminokyseliny, ze kterých se bude syntetizovat bílkovina, musí být aktivovány a následně dopraveny k ribozómům. Jejich aktivace je katalyzována enzymem aminoacyl-tRNA-syntetázou. Při této reakci reaguje karboxylová skupina aminokyseliny s fosfátem skupinou ATP. Vzniklý komplex molekul se nazývá aminoacyladenylát a je enzymaticky přenesen na 3'-konec akceptorového ramene tRNA pro danou aminokyselinu. Vzniká útvar zvaný aminoacyl-tRNA (ve zkratce aa ~ tRNA) a AMP. Tento molekulový komplex obsahuje makroergickou vazbu, která se využije při syntéze peptidové vazby, s jejíž pomocí bude aminokyselina zabudovaná v bílkovině.
Na translaci se podílejí i další bílkoviny, které regulují její průběh. Nazývají se translační faktory. Samotný průběh translace se dělí na iniciaci, elongaci a terminaci.
Iniciace translace začíná vazbou prvního komplexu aa ~ tRNA na malou podjednotku ribozomu. Zároveň se sem váže i mRNA, podle které se bude syntetizovat nový polypeptidový řetězec. První kodon na mRNA, od kterého se translace začíná, má obvykle sekvenci AUG a nazývá se iniciační kodon. Podle sekvenční specifity se s následujícími kodony párují aa ~ tRNA svými antikodony, přičemž na ribozómy vstupují v tzv. A-místě. Peptidová vazba mezi aminokyselinami se tvoří v tzv. P-místě ribozomu, které se nachází převážně na velké podjednotce.
Elongace translace je jinými slovy označení pro syntézu nového polypeptidového řetězce, který tvoří základ nové bílkoviny.
Terminace translace je ukončení proteosyntézy, které nastane zařazením jednoho z terminačních kodonů UAA, UAG nebo UGA. S pomocí terminačních translačních faktorů nastane uvolnění nového polypeptidového řetězce z ribozomu a k rozložení celého translačního komplexu.
Ukončením translace ještě není zaručena funkčnost nové bílkoviny. Proto proces pokračuje kotranslačními a posttranslačními úpravami nového polypeptidu. Kotranslační úpravy probíhají ještě během translace, posttranslační až po ní. Organismus využívá hydroxylaci (hlavně lyzinového a prolinového zbytku), glykosylace, tvorbu disulfitových vazeb, vyštěpování částí polypeptidu, připojování prostetické skupiny a vytvoření struktur vyššího řádu (terciární, kvarterní, supramolekulární), které podmiňují biologickou účinnost bílkoviny.
3.4 Regulace genové exprese
Přítomnost genu na DNA ještě automaticky neznamená, že se jeho informace v organismu projeví, cizím slovem exprimuje. Některé geny jsou aktivní nepřetržitě, jejich transkripce do RNA a následná translace do pořadí aminokyselin probíhá nezávisle na prostředí a stavu buňky. Takové geny se nazývají konstitutivní. Většinou se jedná o geny, které zajišťují základní stavební a strukturní složky buňky. Ty musí být během jejího života neustále doplňovány a obměňováno. Třeba si uvědomit, že každá bílkovina má svůj biologický poločas. Je to průměrný časový úsek, po kterém je už opotřebovaná a je třeba ji nahradit. Proto se genem uvedeného typu říká i housekeeping genes (geny "udržující chod buňky").
Značná část genů se u člověka aktivuje pouze v přesně definovaném úseku jeho života nebo za specifických metabolických podmínek. Tyto geny jsou regulovatelné a jejich projev (exprese) závisí na tom, zda v buňce existuje "poptávka" po produktu, který kódují. Regulace těchto genů se děje na všech úrovních: během transkripce, po transkripci, během translace i po ní.
Samotná transkripce je výrazně ovlivňována regulačními proteiny a transkipčními faktory, které jsou schopny vázat se na specifické sekvence nukleotidů v rámci genu i mimo něj a tím regulovat jeho aktivitu. Pokud vazba regulačního proteinu na sekvenci DNA zesiluje transkripci, nazývá se taková sekvence jako zesilovač transkripce (angl. enhancer). Naopak, jiné proteiny, zvané represory mohou svou vazbou na zeslabovač transkripce (angl. silencer) aktivitu genu snižovat.
Regulace genů v lidském organismu je vícestupňová. Nejdříve se regulační molekuly (např. hormony) vážou na specifický membránový receptor buňky. Následně se aktivuje enzym adenylátcykláza, která katalyzuje přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosinmonofosfát (cAMP). Ten spouští aktivitu specifických enzymů - proteinkináz. Ty fosforylují efektorové proteiny s regulační funkcí. Kromě cAMP organismus používá i molekuly cGMP a ionty Ca2+.
Ani role RNA není v regulaci exprese genů zanedbatelná. Existuje děj zvaný RNA interference (RNAi). Podílejí se na ní dva typy malých molekul RNA, které se označují jako siRNA (ang. small interfering RNA, malé interferující RNA) a miRNA (micro RNA). Oba typy se mohou vázat na různé komplementární sekvence RNA a vytvořit tak dvouřetězcovou formu. Ta je rozpoznána proteinem zvaným Dicer. Ten s pomocí vazby na proteinový komplex RISC (angl. RNA induced silencing complex) dvouřetězcovou RNA rozkládá. Kromě regulace genové exprese má RNAi důležitou roli v ochraně před patogeny (viry).
Vzhledem k tomu, že prokaryotní organismy (bakterie) hrají významnou roli v životě člověka a jeho zdraví, musíme se okrajově zmínit i o regulaci genové exprese u nich. Poprvé ji komplexně popsali Francois Jacob a Jacques Monod v roce 1961 a nazývá se jako operonový model.
Operon je úsek DNA, který nese několik genů, zahrnutých v metabolizaci jediného substrátu. Např. střevní bakterie člověka Escherichia Coli obsahuje operon tvořený geny pro enzymy beta-galaktosidázu beta-galaktozidpermeázu a beta-thiogalaktozidacetyltransferázu. Účastní se metabolizace laktózy. Transkripce všech tří genů začíná od jediného promotoru na začátku. Před promotorem je místo na DNA, na které se váže protein CAP (katabolický aktivační protein) aktivován vazbou s cAMP. Mezi promotorem a geny se kromě toho nachází sekvence nukleotidů, která se nazývá operátor. Na operátor se může vázat regulační protein a řídit přepis všech genů. Řízení operonu závisí od toho, zda se bakterie nachází v prostředí s laktózou, glukózou nebo oběma substráty.
Pokud v prostředí bakterie není laktóza, na operátor laktózového operonu se váže protein nazývaný represor. Represor brání enzymu RNA-polymeráze v transkripci genů, které metabolizují laktózu. Proto se v buňce bakterie nachází pouze několik málo molekul enzymu beta-galaktozidázy. V případě, že se v prostředí bakterie laktóza objeví (např. po požití člověkem), enzym beta-galaktorzdáza ji přemění na allolaktózu, která se váže na represor. Ten se inaktivuje a uvolní na DNA místo pro RNA-polymerázu. Následně může začít transkripce genů, podmíněna zvýšenou potřebou jejich produktů - enzymů na zpracování laktózy. Tento případ regulace se nazývá enzymová indukce.
Katabolická represe je děj, při kterém se v prostředí bakterie (v jejím substrátu) nacházejí laktóza i glukóza. Glukóza svými metabolity inhibuje tvorbu cAMP a tím i aktivaci proteinu CAP, který napomáhá vazbě RNA-polymerázy na promotor laktózového operonu. Geny laktózového metabolismu se nepřepisují, přednost má zpracování glukózy.
Enzymová represe je jev, kdy konečný metabolit biosyntetické dráhy (např. aminokyselina) působí jako tzv. korepresor. Váže se na neaktivní molekulu represoru, který se tak aktivuje a následně dokáže vázat na DNA. Tím se zastaví transkripce genů pro enzymy, potřebné pro syntézu dané aminokyseliny.
Kromě výše uvedených způsobů jsou bakterie schopné regulovat geny s pomocí tzv. antimediátorové RNA. Její sekvence je komplementární k mRNA, proto se na ni váže. Tím inaktivuje její translaci, protože ta u prokaryot následuje hned po transkripci a nepotřebuje zpracování RNA, jako je tomu u člověka.
4 Vztah genetické informace k rozmnožování
Rozmnožování a tvorba potomstva jsou základní charakteristikou živých organismů. V případě pohlavně se rozmnožujících eukaryotních organismů, mezi které patří i člověk, se musí zohlednit jejich tzv. diploidní stav. Znamená to, že v jádře buňky se nachází 23 párů chromosomů, dohromady tedy 46. Chromosomový pár tvoří typově stejnými chromosomy, které však mají různý původ. Každý pochází od jiného rodiče. Schematicky se tato skutečnost označuje symbolem "2n".
Z uvedených skutečností vyplývá, že v lidském organismu se musí využívat dva typy rozmnožování buněk. Prvním typem se zajistí, aby vzniklo potomstvo muže a ženy splynutím jejich pohlavních buněk. Druhým typem je třeba zaručit rozmnožení buněk, specifických pro tkáně a orgány. Výsledkem správného průběhu obou typů dělení je normálně vyvinutý organismus člověka.
V literatuře se jednotlivým typům rozmnožování buněk říká "dělení" buněk. Myslí se tím fakt, že během svého rozmnožování se mateřská buňka rozdělí na několik dceřiných buněk. Pokud má být rozmnožování mateřské buňky úspěšné, dceřiné buňky by měly být stejně životaschopné jako jejich "matka". Z toho vyplývá nutnost, aby zdědili všechny buněčné komponenty a informace o jejich struktuře, které jsou pro buňku životně důležité. Patří sem mitochondrie, které jsou centrem dýchacích procesů. Pro buňku jsou nepostradatelné a bez nich nemůže existovat. Dále je třeba jmenovat Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum, které je centrem proteosyntézy probíhající na ribozomech. Nakonec nelze zapomenout ani na chromozomy, které se nacházejí v jádře a nesou genetickou informaci buňky.
Pokud se buňka chce dělit, musí dostatečně "narůst", aby zajistila dostatek stavebních a strukturálních komponentů pro všechny dceřiné buňky. Rozdělením na dceřiné buňky současně buňka mateřská zaniká.
Můžeme tedy shrnout, že rozmnožování buněk je většinou cyklický děj, který začíná vznikem dceřiné buňky rozdělením její "matky", pokračuje růstem vzniklé buňky a končí jejím dělením na další potomstvo. Tento cyklus se nazývá životní cyklus buňky. Z formálního hlediska se období mezi vznikem buňky z její mateřské předchůdkyně a jejím zánikem dělením nazývá interfáze. Interfáze se dělí na tři časové úseky: G1-fázi, S-fázi a G2-fázi.
G1-fáze se uskutečňuje jako první po vzniku nové buňky. Je typická intenzivní metabolickou aktivitou, charakteristickou pro růst. Dochází během ní k syntéze potřebných enzymů a dalších bílkovin, které jsou nezbytné pro tvorbu jednotlivých strukturních částí buňky.
S-fáze je charakteristická tím, že se během ní syntetizuje DNA. Buňka sice má "svou" DNA, kterou zdědila, ale na to, aby mohla dát šanci vzniknout minimálně dvěma dceřiným buňkám, nutně potřebuje vytvořit co nejpřesnější kopii své DNA. Musí vytvořit kopie všech 46 chromozomů, které se nacházejí v jejím jádře. Nově kopie chromozomů se však během rozdělení mateřské buňky na dceřiné nenacházejí samostatně, ale jsou spojeny se svým "originálem". Pod mikroskopem lze proto vidět typické struktury chromozomů, které jsou jedinečné pouze pro časový úsek dělení buňky. Mají charakteristický tvar připomínající písmeno X. Pozornému pozorovateli neunikne, že i po syntéze kopií chromozomů zůstává přítomen diploidní stav (2n). Abychom však novou situaci odlišili, označujeme ji symbolem 4C. Jinými slovy, z původních dvou kopií určitého chromozomového páru vzniknou další dvě nové, spolu jich je tedy 4 (proto "4C"), které však nejsou samostatné (proto nadále platí "2n", označení diploidních stavu).
G2-fáze je typická syntézou buněčných stavebních složek, potřebných pro nadcházející rozmnožování buňky. Patří sem např. mikrotubuly. Po této fázi může nastat dělení buňky na své dceřiné potomstvo. Všimněte si důležité slůvko "může". Pro organismus je nezbytné regulovat počet buněk jednotlivých tkání a orgánů. Pokud je jich dostatečný počet, pak nově vzniklé buňky se již většinou dále nedělí, ale nahrazují funkčně opotřebované předchůdkyně. V takovém případě mluvíme o speciální fázi života buňky, tzv. "G0" fáze. Je charakteristická dostavbou a dozráním - diferenciací do podoby, ve které buňka vykonává svou roli v organismu. Po jejím opotřebení buňka zaniká, nastává buněčná smrt. Ta však není (s výjimkou např. poškození a traumata) neregulovaná. Naopak, organismus se snaží využít veškerý použitelný materiál zanikající buňky. Mluvíme o apoptóze, tedy o regulované buněčné smrti.
Obrázek 2 - Životní cyklus buňky
Ani sled jednotlivých životních fází není automatický, ale je regulován. Regulátory jsou speciální informační proteiny (tzv. cykliny) a jejich receptory, které mají rovněž enzymatickou funkci. Nazývají se cyklin-dependentní kinázy. Při poruše několikanásobné úrovně regulace rozmnožování buňky může nastat nekontrolované dělení buněk, které je typické pro nádorová onemocnění.
Na životním cyklu buňky vidíme, že převážnou část jejího života tvoří interfáze. Časově kratší rozsah většinou zabírá rozdělení buňky. Během dělení buňky většinou zaniká jaderná membrána. Je to proto, aby spiralizované chromozomy mohly volně nasedat na vlákna dělícího aparátu, který je rozdělí k opačným stranám buňky. Mluvíme proto o tzv. nepřímém dělení buňky. Patří sem mitóza, čili nepřímé somatické dělení buňky a meióza, která je nepřímým redukčním dělením. Obě dělení jsou podrobně vysvětleny v kapitole 4.1. Kromě nich lze výjimečně u některých živých systémů pozorovat rovněž přímé dělení buněk, tzv. amitózu, při kterém jaderná membrána nezaniká. Jádro se podélně prodlouží a rozdělí na dvě části, které jsou základem jader dvou nových dceřiných buněk. V druhém sledu se rozdělí cytoplazmatická membrána, čím se ukončí proces dělení. Amitóza bývá vzácná, častěji jde o atypicky průběh mitózy, tzv. endomitózu.
4.1 Mitosa a meiosa eukaryontních buněk
Mitóza je nejrozšířenějším typem rozmnožování buněk v lidském organismu. Při tomto dělení vznikají z jedné diploidní buňky mateřské dvě diploidní buňky dceřiné. Obě nově vzniklé buňky mají tedy stejný počet chromosomů, jaký měla jejich mateřská buňka. V odborné literatuře se mohou čtenáři setkat s označením mitózy jako nepřímého somatického dělení. Důvod použití slova "nepřímé" byl vysvětlen v předchozí kapitole, proto jenom připomínáme, že souvisí se zánikem jaderné membrány buňky. Mitóza je taky "somatické" dělení. Slouží k rozmnožování somatických (tělních) buněk, které mají diploidní počet chromosomů. Proto je důležitá především v průběhu růstu a vývoje člověka, jakož i při zajišťování recyklace opotřebovaných buněk v jednotlivých orgánech a tkáních novými buňkami.
Mitóza se z hlediska dějů v buňce dělí na čtyři časové úseky: Profázi, metafázi, anafázi a telofázi.
Profáze je počáteční fází mitózy, během které dochází ke spiralizaci chromosomů, proto zpravidla trvá ze všech fází nejdéle. Díky své spiralizaci jsou v této fázi chromosomy pozorovatelné pod světelným mikroskopem. Postupně zaniká jaderná membrána a vzniká dělící vřeténko složené z mikrotubulů.
V metafázi se spiralizované chromosomy přesunou do centrální části buňky (tzv. ekvatoriální roviny buňky). V optickém mikroskopu tak lze pozorovat jejich typické hvězdicovité uspořádání uprostřed buňky, které se nazývá monaster. Chromosomy se spojují s mikrotubuly dělícího vřeténka v místě své centromery. Následně dojde k oddělení obou kopií chromosomu tím, že se centromera rozpadne.
Anafáze je typická přesunem obou polovin genetického materiálu k opačným pólům buňky. Pod světelným mikroskopem je tuto fázi možné rozpoznat právě podle tzv. diasteru, hvězdicovitého uspořádání chromosomů na opačných pólech dělící se buňky.
Telofáze je závěrečnou fází mitózy. Chromosomy se seřadí kolem pólů dělícího vřeténka. Dochází k jejich postupné despiralizaci a začíná se tvořit kolem nich jaderná membrána. Zároveň dochází k rozdělení celého vnitřního prostoru mateřské buňky - cytokineze.
Výsledkem mitózy je vznik dvou dceřiných buněk, které jsou geneticky identické se svou mateřskou buňkou (obrázek 3).
Meióza není na rozdíl od mitózy natolik běžná v lidském organismu i organismech ostatních rostlin i živočichů vůbec. Jejím úkolem není produkovat identické buňky, ale napomáhat v maximalizaci variability daného druhu. Proto úzce souvisí s pohlavním rozmnožováním a tvorbou pohlavních buněk - gamet. Gamety mají pouze polovinu genetické informace (jsou haploidní, "n") v porovnání s rodiči (jsou diploidní, "2n"), kteří je tvoří ve svých pohlavních orgánech (vaječnících nebo varlatech).
Pokud se druh rozmnožuje nepohlavně, je tvořen populací geneticky téměř zcela identických jedinců. V případě nepříznivého vnějšího vlivu (změny ekosystému, patogen) je tak ohrožena celá populace, protože na nepříznivý podnět reaguje uniformně. Pokud však uvažujeme o pohlavním rozmnožování, situace se mění.
Pohlavní rozmnožování vnáší do populace důležitou vlastnost - variabilitu. Pokud máme např. muže, ženu a jejich společné dítě, z genetického hlediska se jedná o tři různé jedince. Rodiče jsou vzájemně odlišní ve své genetické výbavě. Dítě má s každým z rodičů společnou pouze polovinu své genetické informace. Představuje však novou kombinaci u původních genů, která vznikla spojením poloviny genetické informace muže a poloviny genetické informace ženy. V případě jakéhokoli vnějšího vlivu na tuto rodinu (nepříznivé prostředí, patogen) tak musíme uvažovat o rozdílných reakcích třech různých genotypů: otce, matky i dítěte. Vidíme, že variability je dosaženo právě pohlavním rozmnožováním, které vyžaduje pro vznik potomstva dvou jedinců s různým pohlavím. Meióza se proto vyskytuje v pohlavních orgánech a zajišťuje vznik pohlavních buněk (gamet), které musí mít haploidní počet chromosomů proto, aby jejich splynutím vznikl diploidní jedinec.
Meióza se skládá ze dvou po sobě jdoucích dělení: První z nich se nazývá heterotypické dělení a druhé homeotypické dělení. Heterotypické dělení má čtyři fáze: profázi I, metafázi I, anafázi I a telofázi I.
Profáze I: Na začátku meiózy lze pozorovat tzv. bivalenty, stejné chromosomy, které tvoří homologický pár. Po postupné spiralizaci jsou uspořádány vedle sebe. Kromě spiralizace chromosomů se však v této fázi probíhá i výměna nesesterských chromatid mezi oběma chromosomy, které tvoří homologický pár (obrázek 3). Nazývá se rekombinace (angl. crossing-over). Jejím úkolem je zvýšit variabilitu vzájemnou kombinací těch genů, které jsou na jednom chromosomu a nedají se volně kombinovat. Podobně jako v případě mitózy i při meióze představuje tato fáze relativně dlouhé časové období, které je členěno na pět stádií: leptotenní, zygotenní, pachytenní, diplotenní a diakinézi. Jaderná membrána mateřské buňky postupně zaniká.
Metafáze I: Po úplné spiralizaci se chromosomy soustřeďují v ekvatoriální oblasti buňky a spojují se s mikrotubuly dělícího vřeténka.
Anafáze I: K opačným pólům buňky se přesouvají celé chromosomy, tvořené dvěma kopiemi (chromatidy), které jsou spojené centromerou. V tom se anafáze I liší od anafáze mitózy, v níž se centromery rozpadají. Výsledkem anafáze I je snížení počtu chromosomů v budoucích dceřiných buňkách na polovinu (obrázek 3). Každý z obou chromosomů má 50% pravděpodobnost, že se dostane do nově vytvářených gamet. Mluvíme o "rozchodu" chromosomů do dceřiných buněk, o jejich segregaci.
Telofáze I: Dochází k částečné despiralizaci chromosomů, které jsou již soustředěny ve dvou základech haploidních jader. Systém je připraven na homeotypické dělení.
Na obrázku 3 můžeme vidět, že výsledkem heterotypického meiotického dělení jsou dvě dceřiné buňky, které sice mají z dvojice chromosomů pouze jeden (n), ten je ovšem tvořen dvěma kopiemi - chromatidami (2C). Proto musí následovat ještě jedno dělení, které zajistí, aby se obě kopie od sebe oddělily a rozešly do dvou dceřiných buněk. To je úkolem homeotypického dělení, které se tak nazývá proto, že je svým průběhem velmi podobné mitóze. Má čtyři fáze: Profázi II, metafázi II, anafázi II a telofázi II. Jeho výsledkem je rozdělení dvou dceřiných buněk, které pocházejí z heterotypického dělení na výsledné čtyři dceřiné buňky, které mají poloviční (haploidní, „n“) počet chromosomů v jejich jediné kopii (1C, obrázek 3).
Přestože obě pohlaví využívají ve svých pohlavních orgánech meiózu, mezi spermatogenezí muže a oogenezí ženy existují významné rozdíly. Spermatogeneze trvá od puberty po celý život muže a tvoří se miliony spermií. Oogeneze začíná již v prenatálním období ženy a pokračuje od puberty po menopauzu. Na rozdíl od spermatogeneze, při níž vznikají čtyři rovnocenné haploidní prekurzory spermií, oogeneze vede k jedinému zralému haploidnímu oocytu, ostatní pólová tělíska jsou menší a nefunkční.
Amitóza (přímé dělení) je z uvedených dělení nejméně rozšířená. Buňka se dělí tak, že se jádro prodlouží a rozdělí na dvě části, aniž by zanikla jaderná membrána. Následně se rozdělí i zbývající prostor mateřské buňky na dvě buňky dceřiné. Nedochází ke spiralizaci chromosomů, nelze pozorovat ani vlákna dělícího aparátu. Na rozdíl od mitózy a meiózy není v případě amitózy zaručeno rovnoměrné rozdělení genetického materiálu. Proto se u člověka vyskytuje pouze zřídka (u specializovaných buněk, např. tkáně epitelu močového měchýře) a většinou je spojena s patologickými ději (kancerogenezí). Od amitózy je nutné rozlišovat tzv. endomitózu. Jde o zvláštní typ mitózy, během níž nedochází k zániku jaderné membrány.
Profáze je počáteční fází mitózy, během které dochází ke spiralizaci chromosomů, proto zpravidla trvá ze všech fází nejdéle. Díky své spiralizaci jsou v této fázi chromosomy pozorovatelné pod světelným mikroskopem. Postupně zaniká jaderná membrána a vzniká dělící vřeténko složené z mikrotubulů.
V metafázi se spiralizované chromosomy přesunou do centrální části buňky (tzv. ekvatoriální roviny buňky). V optickém mikroskopu tak lze pozorovat jejich typické hvězdicovité uspořádání uprostřed buňky, které se nazývá monaster. Chromosomy se spojují s mikrotubuly dělícího vřeténka v místě své centromery. Následně dojde k oddělení obou kopií chromosomu tím, že se centromera rozpadne.
Anafáze je typická přesunem obou polovin genetického materiálu k opačným pólům buňky. Pod světelným mikroskopem je tuto fázi možné rozpoznat právě podle tzv. diasteru, hvězdicovitého uspořádání chromosomů na opačných pólech dělící se buňky.
Telofáze je závěrečnou fází mitózy. Chromosomy se seřadí kolem pólů dělícího vřeténka. Dochází k jejich postupné despiralizaci a začíná se tvořit kolem nich jaderná membrána. Zároveň dochází k rozdělení celého vnitřního prostoru mateřské buňky - cytokineze.
Výsledkem mitózy je vznik dvou dceřiných buněk, které jsou geneticky identické se svou mateřskou buňkou (obrázek 3).
Meióza není na rozdíl od mitózy natolik běžná v lidském organismu i organismech ostatních rostlin i živočichů vůbec. Jejím úkolem není produkovat identické buňky, ale napomáhat v maximalizaci variability daného druhu. Proto úzce souvisí s pohlavním rozmnožováním a tvorbou pohlavních buněk - gamet. Gamety mají pouze polovinu genetické informace (jsou haploidní, "n") v porovnání s rodiči (jsou diploidní, "2n"), kteří je tvoří ve svých pohlavních orgánech (vaječnících nebo varlatech).
Pokud se druh rozmnožuje nepohlavně, je tvořen populací geneticky téměř zcela identických jedinců. V případě nepříznivého vnějšího vlivu (změny ekosystému, patogen) je tak ohrožena celá populace, protože na nepříznivý podnět reaguje uniformně. Pokud však uvažujeme o pohlavním rozmnožování, situace se mění.
Pohlavní rozmnožování vnáší do populace důležitou vlastnost - variabilitu. Pokud máme např. muže, ženu a jejich společné dítě, z genetického hlediska se jedná o tři různé jedince. Rodiče jsou vzájemně odlišní ve své genetické výbavě. Dítě má s každým z rodičů společnou pouze polovinu své genetické informace. Představuje však novou kombinaci u původních genů, která vznikla spojením poloviny genetické informace muže a poloviny genetické informace ženy. V případě jakéhokoli vnějšího vlivu na tuto rodinu (nepříznivé prostředí, patogen) tak musíme uvažovat o rozdílných reakcích třech různých genotypů: otce, matky i dítěte. Vidíme, že variability je dosaženo právě pohlavním rozmnožováním, které vyžaduje pro vznik potomstva dvou jedinců s různým pohlavím. Meióza se proto vyskytuje v pohlavních orgánech a zajišťuje vznik pohlavních buněk (gamet), které musí mít haploidní počet chromosomů proto, aby jejich splynutím vznikl diploidní jedinec.
Meióza se skládá ze dvou po sobě jdoucích dělení: První z nich se nazývá heterotypické dělení a druhé homeotypické dělení. Heterotypické dělení má čtyři fáze: profázi I, metafázi I, anafázi I a telofázi I.
Profáze I: Na začátku meiózy lze pozorovat tzv. bivalenty, stejné chromosomy, které tvoří homologický pár. Po postupné spiralizaci jsou uspořádány vedle sebe. Kromě spiralizace chromosomů se však v této fázi probíhá i výměna nesesterských chromatid mezi oběma chromosomy, které tvoří homologický pár (obrázek 3). Nazývá se rekombinace (angl. crossing-over). Jejím úkolem je zvýšit variabilitu vzájemnou kombinací těch genů, které jsou na jednom chromosomu a nedají se volně kombinovat. Podobně jako v případě mitózy i při meióze představuje tato fáze relativně dlouhé časové období, které je členěno na pět stádií: leptotenní, zygotenní, pachytenní, diplotenní a diakinézi. Jaderná membrána mateřské buňky postupně zaniká.
Metafáze I: Po úplné spiralizaci se chromosomy soustřeďují v ekvatoriální oblasti buňky a spojují se s mikrotubuly dělícího vřeténka.
Anafáze I: K opačným pólům buňky se přesouvají celé chromosomy, tvořené dvěma kopiemi (chromatidy), které jsou spojené centromerou. V tom se anafáze I liší od anafáze mitózy, v níž se centromery rozpadají. Výsledkem anafáze I je snížení počtu chromosomů v budoucích dceřiných buňkách na polovinu (obrázek 3). Každý z obou chromosomů má 50% pravděpodobnost, že se dostane do nově vytvářených gamet. Mluvíme o "rozchodu" chromosomů do dceřiných buněk, o jejich segregaci.
Telofáze I: Dochází k částečné despiralizaci chromosomů, které jsou již soustředěny ve dvou základech haploidních jader. Systém je připraven na homeotypické dělení.
Na obrázku 3 můžeme vidět, že výsledkem heterotypického meiotického dělení jsou dvě dceřiné buňky, které sice mají z dvojice chromosomů pouze jeden (n), ten je ovšem tvořen dvěma kopiemi - chromatidami (2C). Proto musí následovat ještě jedno dělení, které zajistí, aby se obě kopie od sebe oddělily a rozešly do dvou dceřiných buněk. To je úkolem homeotypického dělení, které se tak nazývá proto, že je svým průběhem velmi podobné mitóze. Má čtyři fáze: Profázi II, metafázi II, anafázi II a telofázi II. Jeho výsledkem je rozdělení dvou dceřiných buněk, které pocházejí z heterotypického dělení na výsledné čtyři dceřiné buňky, které mají poloviční (haploidní, „n“) počet chromosomů v jejich jediné kopii (1C, obrázek 3).
Přestože obě pohlaví využívají ve svých pohlavních orgánech meiózu, mezi spermatogenezí muže a oogenezí ženy existují významné rozdíly. Spermatogeneze trvá od puberty po celý život muže a tvoří se miliony spermií. Oogeneze začíná již v prenatálním období ženy a pokračuje od puberty po menopauzu. Na rozdíl od spermatogeneze, při níž vznikají čtyři rovnocenné haploidní prekurzory spermií, oogeneze vede k jedinému zralému haploidnímu oocytu, ostatní pólová tělíska jsou menší a nefunkční.
Amitóza (přímé dělení) je z uvedených dělení nejméně rozšířená. Buňka se dělí tak, že se jádro prodlouží a rozdělí na dvě části, aniž by zanikla jaderná membrána. Následně se rozdělí i zbývající prostor mateřské buňky na dvě buňky dceřiné. Nedochází ke spiralizaci chromosomů, nelze pozorovat ani vlákna dělícího aparátu. Na rozdíl od mitózy a meiózy není v případě amitózy zaručeno rovnoměrné rozdělení genetického materiálu. Proto se u člověka vyskytuje pouze zřídka (u specializovaných buněk, např. tkáně epitelu močového měchýře) a většinou je spojena s patologickými ději (kancerogenezí). Od amitózy je nutné rozlišovat tzv. endomitózu. Jde o zvláštní typ mitózy, během níž nedochází k zániku jaderné membrány.
Obrázek 3 - Porovnání tří základních dělení buněk
Legenda: Ačkoliv člověk obsahuje 23 párů chromosomů, pro zjednodušení a názornost jsou uvedeny pouze dva homologní páry chromosomů, které se liší velikostí. Odlišná barva (černá, resp. šedá) znázorňuje různý původ chromosomů od obou rodičů sledovaného jedince. Písmeno "n" udává ploidii (2n - diploidie, n-haploidie). Písmeno C udává absolutní počet kopií chromosomů v buňce bez ohledu na ploidii.
Legenda: Ačkoliv člověk obsahuje 23 párů chromosomů, pro zjednodušení a názornost jsou uvedeny pouze dva homologní páry chromosomů, které se liší velikostí. Odlišná barva (černá, resp. šedá) znázorňuje různý původ chromosomů od obou rodičů sledovaného jedince. Písmeno "n" udává ploidii (2n - diploidie, n-haploidie). Písmeno C udává absolutní počet kopií chromosomů v buňce bez ohledu na ploidii.
Ačkoliv člověk obsahuje 23 párů chromosomů, pro zjednodušení a názornost jsou uvedeny pouze dva homologní páry chromosomů, které se liší velikostí. Odlišná barva (černá, resp. šedá) znázorňuje různý původ chromosomů od obou rodičů sledovaného jedince. Písmeno "n" udává ploidii (2n - diploidie, n-haploidie). Písmeno C udává absolutní počet kopií chromosomů v buňce bez ohledu na ploidii.
4.2 Rozmnožování prokaryontních buněk
Bakteriální (obecně prokaryontní) buňky jsou považovány za haploidní. Na rozdíl od eukaryontních buněk se rozmnožují tzv. binárním dělením. V průběhu růstu bakterie se replikuje i její chromosom. Dělení bakterie začíná syntézou cytoplazmatické membrány a buněčné stěny, které postupně oddělí dceřinou buňku od mateřské. Binární dělení bakterií se svým mechanismem ani průběhem nedá srovnávat s rozmnožováním eukaryontních buněk. Je mnohem jednodušší a trvá nepoměrně kratší dobu.
4.3 Segregace a kombinace vloh
Z předešlých kapitol již víme, že dospělý člověk je diploidní a každý z 23 lidských chromosomů je u něj přítomen ve dvou kopiích. Z toho vyplývá, že pokud sledujeme gen na kterémkoliv z chromosomů, v lidském organismu bude (s částečnou výjimkou pohlavních chromosomů) přítomen ve dvou kopiích. Obě kopie, které se u daného jedince nacházejí, nemusí být identické, ale mohou se lišit. Různé varianty téhož genu nazýváme alely. Jejich vnější projev závisí na tom, do jaké míry jsou schopny se projevit. Alela, která se projeví i v přítomnosti jiné alely na druhém homologním chromosomu, se označuje jako dominantní. Recesivní alela je taková varianta genu, která se projeví, pouze pokud je u sledovaného člověka přítomna na obou homologních chromosomech. Z toho vyplývá i označení jedinců podle toho, jaké alely sledovaného genu se na jejich chromosomech nacházejí. Dominantní homozygot má na obou chromosomech homologického páru dominantní alelu. Heterozygot má přítomny dvě různé alely, z nichž jedna je dominantní. Recesivní homozygot má obě alely stejné, recesivní. Názorným příkladem je dědičnost alel genu pro krevně-skupinový systém ABO (tabulka 2). Alely IA a IB jsou dominantní vůči alele i. V případě, že je jedinec heterozygot, který od jednoho z rodičů zdědil alelu IA a od druhého rodiče alelu i, bude mu při hematologickém testování stanovena krevní skupina A. Obdobně to platí i pro kombinaci alely IB a i. Alely IA a IB jsou však kodominantní. Tento pojem označuje stav, kdy se projeví obě alely, které jsou přítomny u člověka. Jinými slovy, obě alely jsou stejně "silné" a ani jedna z nich nepotlačuje projev druhé.
Tabulka 2 Kombinace alel krevně-skupinového systému ABO
Krevní skupina jedince |
Genotyp jedince | |
Homozygot |
Heterozygot | |
A |
IA IA |
IA i |
B |
IB IB |
IB i |
AB |
- |
IA IB |
ii |
- | |
Při důkladném prostudování tabulky 2 můžeme dojít k následujícím klíčovým zjištěním:
- Krevní skupina není „fenotypový" projev, který lze zkoumat pouhým okem, ale musí se stanovit laboratorně (např. v krevní bance).
- Jedinci s krevní skupinou A nebo B představují směs dvou různých genotypů. Jeden představuje homozygoty pro dominantní alelu (IA IA nebo IB IB) druhý heterozygoti (IA i nebo IB i), u kterého dominantní alela potlačí projev alely i.
- Jedinci s krevní skupinou AB jsou výlučně heterozygoti.
- Jedinci s krevní skupinou 0 jsou výlučně recesivní homozygoti.
Uvedený příklad krevních skupin je názornou ukázkou důsledků pohlavního rozmnožování. Jak bylo uvedeno v kapitole 4.1, pohlavní rozmnožování využívá meiózu. Při ní dochází k rozdělení - segregaci obou chromosomů homologického páru v gametách jedince. Po splynutí jeho gamety s gamety jedince opačného pohlaví vznikne nová kombinace alel u jejich potomka. Projevy dědičnosti byly zkoumány od nepaměti a lidé využívali empirické poznatky při šlechtění plemen užitkových a domácích zvířat. Vědecký základ však této oblasti poskytl až Johann Gregor Mendel, který publikoval výsledky svých pokusů s křížením hrachu (Pisum sativum L.) v roce 1865. Uplynulo však ještě více než třicet let než Hugo de Vries, Carl Correns a Erich von Tschermak znovuobjevili jeho práci na počátku 20. století.
Mendelův přínos spočívá v tom, že se pokusil empiricky pozorované projevy dědičnosti znaků definovat matematicky. Jeho zjištění, známé jako "Mendelova pravidla", jsou platné dodnes. Dříve, než si je vysvětlíme, musíme si definovat podmínky, za kterých platí. První podmínkou je, aby byly námi sledované geny lokalizovány na různých chromosomech. Kromě toho, všechny geny by měly být umístěny na somatických, nepohlavních chromosomech - autozomech. Znaky, podmíněné sledovanými alelami genů by měly být identifikovatelné a neměly by na jedince působit letálně. Pro lepší matematickou výpovědní hodnotu se dají Mendelova pravidla elegantně ověřit na živých organismech s kratší reprodukční dobou a dostatečným počtem potomstva, které vzniklo pohlavním rozmnožováním.
Dříve než se budeme věnovat Mendelovým pravidlům, je nutno uvést specifické symboly, které se při genetickém zápisu používají:
P rodičovská (parentální) generace
F1 potomstvo křížení rodičů (první filiální generace)
F2 potomstvo křížení generace F1 (druhá filiální generace, vnuci generace P)
GP gamety parentální generace (spermie, vajíčka)
GF1 gamety generace F1
B zpětné křížení potomků s jedincem identického genotypu, jaký měl jeden z rodičů v parentální generaci
♀ označení ženského pohlaví v zápise genetického křížení
♂ označení mužského pohlaví v zápise genetického křížení
x symbol křížení
R dominantní alely se obecně označují velkými písmeny
r recesivní alely se obecně označují malými písmeny
Rh-faktor u člověka je kódován geny, lokalizovanými na chromosomu č. 1 (lokace 1p34-36). Nejdůležitější z nich je gen, který kóduje antigen D. Má dvě alely, přičemž dominantní alela R je zodpovědná za tvorbu antigenu. Recesivní alela r nepodmiňuje tvorbu antigenu D v důsledku delečních změn, kterými se liší od dominantní alely R.
Představme si manželský pár. Žena je genotypově dominantní homozygot s oběma dominantními alelami RR, proto je fenotypově Rh+. Muž je recesivní homozygot rr, proto je při hematologickém vyšetření určený jako Rh-. Z obrázku 2 je patrno, že z obou kopií genů (alel) se při gametogenezi může dostat do gamety (spermie, vajíčka) pouze jedna alela, proto vajíčka ženy obsahují pouze jednu z obou dominantních alel R. Spermie muže nesou také pouze jednu z obou recesivních alel r. Bez ohledu na to, kolik bude mít uvedený pár dětí, všechny děti budou z hlediska Rh-faktoru identické. Fenotypově budou při vyšetření Rh+ a z hlediska genotypu se bude jednat o heterozygoty Rr, kteří obsahují jednu dominantní alelu R od matky a jednu recesivní alelu r od otce.
♀ ♂
P: RR x rr
GP: R r
F1: Rr
Uvedený genetický zápis je příkladem prvního Mendelova pravidla uniformity a reciprocity: Při křížení rodičů homozygotních ve sledovaném znaku (generace P) jsou všichni jejich potomci stejní - uniformní genotypově (Rr) i fenotypově (hematologické vyšetření prokáže Rh+). Zároveň je jedno, který z obou rodičů byl dominantní homozygot a který recesivní homozygot, protože se jedná o gen na somatickém chromosomu (autozomu). Všimněte si, že při genotypu ženy rr a genotypu muže RR bychom pozorovali stejné potomstvo. Jedná se tedy o vzájemnou zaměnitelnost – reciprocitu genotypů.
Poznámka: Při genetickém zápisu se vždy píše jako první dominantní alela. Alely jednotlivých genů se musí psát vždy spolu (správně: Rr, RrBB; špatně: rRBb, RbrB)!
Pokud by si dítě uvedeného páru našlo genotypově shodného partnera (heterozygota Rr, označený červeně), můžeme uvažovat o zplození další generace, druhé filiální generaci F2. V tomto případě však rodiče tvoří dva typy gamet. Polovina z nich obsahuje dominantní alelu R a druhá polovina má recesivní alelu r.
♀ ♂
F1 Rr x Rr
GF1 R ; r R ; r
½ ; ½ ½ ; ½ Pravděpodobnost vzniku gamet
F2 RR : Rr + Rr : rr
¼ ½ ¼ Pravděpodobnost vzniku potomků
1 : 2 : 1 Genotypový štěpný poměr
3 Rh+ : 1 Rh- Fenotypový štěpný poměr
Na generaci F2 můžeme sledovat druhé Mendelovo pravidlo štěpení znaků: V případě křížení heterozygotní generace F1 se v jejím potomstvu F2 znovu objeví kombinace, jaké měla rodičovská generace P. Na základě pravděpodobnosti vzniku jednotlivých gamet si můžeme vysvětlit genotypové a fenotypové štěpné poměry F2 generace potomků. Oba rodiče tvoří gamety nesoucí alelu R s pravděpodobností ½ a gamety s recesivní alelou r s pravděpodobností ½. Proto pravděpodobnost, že dítě v F2 generaci bude dominantní homozygot RR, činí ¼ (½R · ½R = ¼RR) a pravděpodobnost recesivního homozygota rr představuje rovněž ¼ (½r · ½r = ¼rr). Pravděpodobnost vzniku heterozygota Rr bude ½ ((½R · ½r) + (½R· ½r) = ½Rr). Fenotypový štěpný poměr je jiný, protože v případě heterozygotů Rr překryje dominantní alela R projev recesivní alely r, proto dítě bude vyšetřeno jako Rh+. S pravděpodobností ¾ bude generace F2 vykazovat Rh+ a pouze ¼ dětí bude Rh-.
V případě gamet obou generací je vidět princip třetího Mendelova pravidla o čistotě gamet. Gameta může z daného páru chromosomů jedince obsahovat pouze jeden chromosom.
Až dosud jsme sledovali jeden znak. Jedinci F1 generace s genotypem Rr se nazývají monohybridi, protože vznikly křížením (hybridizací) rodičovských homozygotů. Pokud sledujeme dva geny, mluvíme o dihybridismu, v případě tří znaků o trihybridismu a v případě více znaků o polyhybridismu.
Pokud bychom sledovali několik genů zároveň, bude platit čtvrté pravidlo o nezávislé kombinaci genů. Alely jednoho sledovaného genu se dědí a kombinují nezávisle na alel druhého sledovaného genu. Názorným příkladem je sledování krevně-skupinového systému ABO (gen se nachází na chromosomu č. 9, lokace 9q34.1-34.2) a Rh-faktoru: Pro názornost jsou oba geny označeny jinou barvou.
Křížení parentální generace: ♀ ♂
P: RRIAIA x rrii
Rh+, krevní skupina A Rh-, krevní skupina O
Gamety rodičovské generace:
GP: RIA ri
F1: RrIAi
Rh+, krevní skupina A
Křížení generace F1:
F1: RrIAi x RrIAi
GF1: RIA ; Ri ; rIA; ri RIA ; Ri ; rIA; ri
Tabulka 3 Kombinační tabulka vzniku generace F2 z gamet generace F1
Gamety generace F1 |
Žena | ||||
RIA |
Ri |
rIA |
ri | ||
Muž |
RIA |
RRIAIA Rh+, krevní skupina A |
RRIAi Rh+, krevní skupina A |
RrIAIA Rh+, krevní skupina A |
RrIAi Rh+, krevní skupina A |
Ri |
RRIAi Rh+, krevní skupina A |
RRii Rh+, krevní skupina O |
RrIAi Rh+, krevní skupina A |
Rrii Rh+, krevní skupina O | |
rIA |
RrIAIA Rh+, krevní skupina A |
RrIAi Rh+, krevní skupina A |
rrIAIA Rh-, krevní skupina A |
rrIAi Rh-, krevní skupina A | |
ri |
RrIAi Rh+, krevní skupina A |
Rrii Rh+, krevní skupina O |
rrIAi Rh-, krevní skupina A |
rrii Rh-, krevní skupina O | |
Legenda: Kombinací gamet generace F1 (modré pozadí) vznikne generace F2 (bílé pozadí). U každého genotypu generace F2 je uveden i fenotyp.
Důležitá poznámka: Všechny čtyři typy gamet (RIA; Ri; rIA; ri) se u obou pohlaví F2 generace tvoří se stejnou pravděpodobností 1: 1: 1: 1 (čili ¼ + ¼ + ¼ + ¼ = 1).
Genotypový štěpný poměr: 1 : 2 : 1 : 2 : 4 : 2 : 1 :2 :1
V tabulce jsou zastoupeny genotypové kategorie:
1x RRIAIA
2x RRIAi
1x RRii
2x RrIAIA
4x RrIAi
2x Rrii
1x rrIAIA
2x rrIAi
1x rrii
Fenotypový štěpný poměr: 9 : 3: 3: 1
9x Rh+, krevní skupina A
3x Rh+, krevní skupina O
3x Rh-, krevní skupina A
1x Rh-, krevní skupina O
Poznámka: Součet 1 + 2 + 1 + 2 + 4 + 2 + 1 + 2 + 1 = 16, což představuje kombinaci 4 typů gamet obou rodičů (kombinační tabulka 4 x 4 = 16). Součet fenotypových tříd 9 + 3 + 3 + 1 = 16.
Pravidlo o nezávislé kombinaci alel obou sledovaných genů si můžeme ověřit přímo v kombinační tabulce 3. Pokud budeme sledovat pouze gen pro Rh-faktor, v tabulce zjistíme přítomnost 4 dominantních homozygotů RR, 8 heterozygotů Rr a 4 recesivních homozygotů rr. Po vydělení čtyřmi dostaneme základní genotypový štěpný poměr platný pro monohybridismus: 1: 2: 1 (tabulka 3). Obdobně to platí i pro systém ABO.
Na závěr této kapitoly je třeba uvést několik zajímavých poznámek k tabulce 2.
- Krevně-skupinový systém ABO nám ukazuje, že i když gen má v populaci více než dvě alely, u jedince mohou být přítomny pouze dvě z nich. Např. v uvedeném příkladu matky s genotypem IAIA a otce s genotypem ii už není místo pro třetí alelu IB. Naopak, jedinec s genotypem IBIB už nemůže mít žádnou ze zbývajících alel IA nebo i.
- Z tabulky 2 vyplývá, že rodič s krevní skupinou AB (genotyp IAIB) nikdy nemůže mít dítě s krevní skupinou 0 (genotyp ii). Rodič s krevní skupinou 0 může mít dítě se shodnou krevní skupinou 0 s partnerem s krevní skupinou 0, nebo s partnerem s krevní skupinou A (v heterozygotním stavu IAi), případně B (v heterozygotním stavu IBi).
- V případě rodičů s genotypy IAi x IBi jsou u jejich dětí teoreticky možné všechny čtyři krevní skupiny (genotypy: IAIB; IAi; ii; IBi).
4.4 Vazba genů
V předchozím příkladu jsme měli dva geny, umístěné na dvou různých chromosomech. Rh-faktor je determinován geny, které jsou umístěny na chromosomu č. 1, a systém ABO je podmíněn geny, lokalizovanými na chromosomu č. 9. Lidský genom však obsahuje přibližně 30000 genů, které jsou rozloženy na celkově 23 párech chromosomů. Z toho vyplývá velká pravděpodobnost, že při sledování několika genů současně se tyto mohou nacházet na stejném chromosomu. Významnou práci v této oblasti provedli T.H. Morgan a W. Bateson v první polovině dvacátého století. Dnes můžeme poznatky v této oblasti shrnout do tzv. Morganových pravidel:
- Geny jsou umístěny na DNA chromosomu, přičemž jsou uspořádány lineárně za sebou.
- Geny na jednom chromosomu tvoří tzv. vazebnou skupinu. Počet vazebných skupin v organismu je shodný s počtem homologních párů chromosomů.
- Mezi geny homologického páru chromosomů může nastat kombinace genetického materiálu. Děje se tak prostřednictvím rekombinace (crossing-overu). Výskyt crossing-overu je přímo úměrný vzdálenosti genů. Čím jsou geny od sebe vzdálenější, tím vyšší je pravděpodobnost rekombinace mezi nimi.
Představme si situaci, že se dva hypotetické geny M a R nacházejí na stejném chromosomu. V takovém případě lze jedince heterozygotní pro oba znaky zapsat dvěma způsoby:
M R nebo M r
m r m R
Vidíme, že existují dvě možnosti. Vlevo je případ, kdy jsou obě dominantní alely M a R na jednom chromosomu, přičemž na druhém chromosomu jsou pouze recesivní alely m, r. Takové uspořádání alel se nazývá "fáze cis". Vpravo je schéma jedince, který má na jednom chromosomu homologického páru dominantní alelu M a recesivní r a na druhém chromosomu obráceně. Na rozdíl od jedince vlevo má na jednom chromosomu různé typy alel - i dominantní i recesivní. Uvedené uspořádání alel se nazývá "fáze trans".
Bylo by obrovskou chybou, pokud bychom toto uspořádání zapsali "mendelistickým" zápisem MmRr. Je sice pravda, že tento zápis formálně bere v úvahu dominantní i recesivní alely obou genů, ale není z něj jasná klíčová věc - že geny jsou umístěny na stejném chromosomu, tedy ve vazbě. Dvojitá čára mezi geny znázorňuje dva homologní chromosomy jediného páru, na kterém jsou umístěny. Pokud by neexistovala rekombinace, oba jedinci by produkovali v důsledku vazby genů ne čtyři typy gamet, ale pouze dva. Pokud by však mezi geny vznikl crossing-over, vznikly by další dva typy gamet. Protože proces rekombinace je náhodný, počet vzniklých gamet s "rekombinovanými" geny M a R bude vždy nižší ve srovnání s "rodičovskými" kombinacemi genů M a R v gametách, které vznikly jednoduchou segregací chromosomů: Všimněte si, že fáze cis a trans se liší v typu "rodičovských" a "rekombinovanými" gamet - jsou recipročně obrácené.
Jedinci:
M R nebo M r
m r m R
fáze cis fáze trans
Gamety:
M R M r rodičovské gamety
m r m R rodičovské gamety
M r M R rekombinované gamety
m R m r rekombinované gamety
Jak zjistíme, zda má jedinec uspořádané geny ve fázi cis nebo trans? Řešení nám naznačuje poznatek, že na rozdíl od volné kombinovatelnosti genů nebude počet jednotlivých typů gamet shodný, ale nerekombinované rodičovské sestavy budou v gametách vždy početnější. Tuto skutečnost dokáže odkrýt tzv. zpětné křížení (B) testovaného jedince s dvojitým recesivním homozygotem.
B M R X m r M r X m r
m r m r m R m r
fáze cis fáze trans
GB M R; m r; M r; m R m r M R; m r; M r; m R m r
B1
M R M r
m r m r
m r m R
m r m r
M r M R
m r m r
m R m r
m r m r
Vidíme, že recesivní homozygot je při tomto křížení důležitý proto, že tvoří stejné gamety s recesivními alelami m r i v případě, že mezi geny vznikl crossing-over. Kromě toho, v případě křížení heterozygota s recesivním homozygotem jsou genotypové počty rozlišitelné i fenotypově. Jinými slovy, v případě zpětného křížení jsou genotypové i fenotypové štěpné poměry shodné.
Splynutím rodičovských gamet generace B vzniknou jedinci v generaci potomků B1. Černou barvou jsou označeni jedinci, kteří od heterozygotního rodiče zdědili původní, tedy nerekombinované rodičovské kombinace alel. Modrou barvou jsou označeni potomci, kteří vznikli z gamet, které obsahovaly rekombinovanou sestavu genů. Těchto "rekombinovaných" jedinců je vždy méně než jedinců s původní rodičovskou sestavou alel.
Míra rekombinace se dá využít k určení vzdálenosti mezi geny, které jsou ve vazbě. Pokud bychom udávali vzdálenosti mezi nimi v absolutních počtech párů bází, čísla by dosahovaly obrovské numerické hodnoty. Proto je výhodnější určit frekvenci rekombinace. Obecně platí, že čím jsou geny k sobě blíž, tím menší je pravděpodobnost vzniku crossing-overu. Pokud budeme sledovat dva geny v potomstvu zpětného křížení, můžeme určit jejich vzájemnou vzdálenost, která je udávána v centimorganech (cM) a představuje procento jedinců potomstva, kteří nesou rekombinované sestavy sledovaných genů. Nazývá se Morganovo číslo p a je určeno následujícím vztahem:
p(%; cM) = (počet rekombinantů / počet všech jedinců) · 100
Kromě toho můžeme určit, s jakou frekvencí se častěji tvoří rodičovské nerekombinované sestavy alel sledovaných genů v porovnání s uspořádáním, které vzniklo díky crossing-overu. Tato frekvence se nazývá Batesonovo číslo c a platí pro ni vztah:
c(x) = (počet rodičovských kombinací/počet rekombinací)
Mezi oběma čísly platí přepočítací vztahy:
p = 100/(c + 1) c = (100 – p)/p
Příklad 1: Předpokládejte, že u laboratorního potkana jsou geny N a E ve vazbě. Určete vzdálenost mezi nimi. Máte k dispozici počty jednotlivých genotypových i fenotypových kategorií v potomstvu.
B N E X n e
n e n e
B1 Genotyp: Zjištěné počty jedinců:
N E 40
n e
n e 30
n e
N e 16
n e
n E 14
n e
Řešení: V generaci potomstva křížení heterozygota jsme pozorovali 70 jedinců s nerekombinovanými rodičovskými sestavami a 30 jedinců, kteří vznikli rekombinací genů N a E. Po dosazení do vztahu pro výpočet Morganová čísla p dostáváme:
p = (30/100) · 100 c = 70/30
p = 30 % (cM) c = 2,33x
Vzdálenost mezi geny činí 30 cM, procento jedinců potomstva, kteří nesou ve svém genotypu rekombinované sestavu alel sledovaných genů, představuje 30 %. Rodičovské kombinace se v gametách heterozygotů vyskytují 2,33 krát častěji než rekombinovanými sestavami. V generaci B1 pozorujeme, že vyšší počet jedinců se genotypově i fenotypově podobá oběma rodičům. Potomků, kteří mají pouze jednu dominantní alelu v genotypu, je méně, protože všichni vznikli výhradně díky crossing-overu. Proto se fáze cis nazývá také "coupling" (z angl. coupling - spojení, vazba).
Příklad 2: Předpokládejte, že u laboratorního potkana jsou geny M a R ve vazbě. Určete vzdálenost mezi nimi. Máte k dispozici počty jednotlivých genotypových a fenotypových kategorií v potomstvu.
B M r X m r
m R m r
B1 Genotyp: Zjištěné počty jedinců:
M r 40
m r
m R 30
m r
M R 16
m r
m r 14
m r
Řešení: V generaci potomstva křížení heterozygota jsme pozorovali 80 jedinců s nerekombinovanými rodičovskými sestavami a 20 jedinců, kteří vznikli rekombinací genů M a N. Po dosazení do vztahu pro výpočet Morganová čísla p dostáváme:
p = (20/100) · 100 c = 80/20
p = 20 % (cM) c = 4,0x
Vzdálenost mezi geny činí 20 cM, procento jedinců potomstva, kteří nesou ve svém genotypu rekombinovanou sestavu alel sledovaných genů, představuje 20 %. Rodičovské kombinace se v gametách heterozygotů vyskytují 4 krát častěji než rekombinované sestavy. Jedinců v B1 generaci, kteří se genotypově a fenotypově podobají oběma rodičům, je méně, než bychom očekávali. Je to typické pro heterozygotní rodiče ve fázi trans, která se proto nazývá také "repulsion" (z angl. repulsion – odpuzování, averze).
4.5 Genetická informace a pohlaví
Při pohledu na karyotyp muže (obrázek 4) je vidět, že pohlavní chromosomy (gonozomy) X a Y se velikostí i morfologií vzájemně liší. Polovina spermií muže obsahuje chromosom X a druhá polovina chromosom Y. Proto se mužské pohlaví nazývá heterogametické. Žena má ve svém genotypu dva chromosomy X, proto se označuje jako homogametické pohlaví. Chromosom Y se v literatuře označuje také jako alozom. Heterogametické pohlaví určuje poměr mužského a ženského pohlaví v další generaci, která činí ½ ♀ : ½ ♂.
Uvedený poměr však u člověka není neměnný. Primární poměr pohlaví (poměr pohlaví zygot těsně po splynutí gamet) je posunut výrazně ve prospěch heterogametického pohlaví. Sekundární poměr pohlaví se stanoví při narození dětí a činí 100 děvčat: 105 chlapců. Terciární poměr pohlaví je zjišťován v pozdějších stadiích postnatálního vývoje. U gerontů činí přibližně 100 žen: 50 mužům.
I když jsou gonozomy při chromosomovém určení pohlaví důležité, nejsou jedinými faktory, které ho podmiňují. Důležitou roli hrají i tzv. feminní a maskulinní faktory. Jsou to genové komplexy, které se nacházejí jak na monozomech, tak i na autozomech a spolupodílejí se na vývoji pohlaví. Mluvíme o genotypovém určení pohlaví.
Obrázek 4 - Karyotyp muže
Morfologické rozdíly mezi gonozomy X a Y musíme brát v úvahu v případě genů, které se na nich nacházejí. Chromosom X (a v menším rozsahu i chromosom Y) obsahují oblast, ve které nejsou shodné - homologní. V případě, že se geny nacházejí v nehomologní oblasti gonozomu, mluvíme o znacích úplně vázaných na pohlaví. Příkladem je dědičnost hemofilie. Je to porucha srážlivosti krve, podmíněná mutací genu pro koagulační faktor, který se nachází na nehomologním úseku chromosomu X. Tento úsek nemá shodný protějšek na chromosomu Y. Proto se u muže gen pro koagulační faktor nachází pouze v jediné kopii na chromosomu X, zatímco u ženy je přítomen ve dvou kopiích na obou chromosomech X. Mohou nastat následující kombinace:
Genotyp Fenotyp
XHXH zdravá žena s oběma zdravými alelami
XHXh zdravá žena s jednou mutantní alelou (přenašečka, konduktorka)
XhXh žena s oběma mutantními alelami (nemocná na hemofilii)
XHY zdravý muž s jedinou zdravou alelou na chromosomu X
XhY nemocný muž s jedinou mutantní alelou na chromosomu X
Z uvedených zápisů genotypů vyplývají důležité závěry:
- Všimněte si prosím způsobu genetického zápisu. Úplnou vazbu genu na pohlaví zaznamenáváme tak, že jako hlavní znak zapíšeme symbol příslušného gonozomu (X nebo Y) a jako jeho pravý dolní index píšeme vlastní symbol konkrétní alely sledovaného genu. Vazba na pohlaví tedy znamená, že ve skutečnosti jsme nuceni sledovat znaky dva - vlastní gen a chromosomovou determinaci pohlaví jedince.
- Muž nikdy nemůže být heterozygotní pro gen, který je zcela vázán na nehomologní úsek chromosomu X, protože může mít v genotypu pouze jediný chromosom X. Z toho vyplývá, že pro sledovaný gen, který je zcela vázán na nehomologní úsek X, obsahuje pouze jednu jedinou alelu. Tento zvláštní případ u muže se nazývá hemizygotní stav.
Pro geny umístěny na nehomologních úsecích chromosomu X je typická tzv. dědičnost křížem. V případě, že žena je pro sledovaný znak recesivní homozygot, v další generaci zdědí její fenotyp opačné pohlaví - tedy její syn. Příkladem může být dědičnost daltonizmu. Je to porucha vnímání zvláště červené a zelené oblasti barevného spektra. Gen je lokalizován na nehomologním úseku chromosomu X. Pokud je matka recesivně homozygotní pro sledovaný znak (s poruchou barvocitu) a muž obsahuje na svém jediném chromosomu X zdravou alelu, jejich děti nebudou fenotypově uniformní. Dcery budou zdravé (ovšem heterozygotní přenašečky) a synové nebudou rozeznávat červenou a zelenou barvu.
Poznámka: Všimněte si, že označování pohlaví symboly ♀, ♂ je zde zcela zbytečné.
Dědičnost křížem – daltonismus:
P XdXd x XDY
„barvoslepá“ „zdravý“
GP Xd XD ; Y
F1 XDXd XdY
„zdravá“ „barvoslepý“
Pro geny umístěny na nehomologním úseku chromosomu Y je typická přímá dědičnost, nazývaná i dědičnost holandrická. Znak přechází z jednoho mužského potomka na dalšího a vždy se fenotypově projeví. Příkladem je gen, který podmiňuje hypertrichosis auriculae. Je to nadměrné ochlupení horní a zadní části ušního boltce. Vyskytuje se výlučně u mužů.
Dědičnost přímá – holandrická:
P XX x XYH
„hypertrichosis auriculae“
GP X X ; YH
F1 XX XYH
„hypertrichosis auriculae“
V některých učebnicích genetiky se uvádí, že dědičnost genů, které jsou lokalizovány na homologních úsecích chromozomů X a Y se řídí stejnými pravidly, jako dědičnost genů lokalizovaných na autozomech. Důrazně upozorňujeme, že to sice pravda je, ovšem není úplná. Názorně nám to vysvětlí příklad hypotetických genů A a B u laboratorního potkana, které jsou lokalizovány v homologním úseku gonozomů. V tomto případě říkáme o znacích neúplně vázaných na pohlaví.
Neúplná vazba genu na pohlaví - dvě možnosti dominantního a recesivního homozygota vzhledem k pohlaví:
P XAXA x XaYa anebo XaXa x XAYA
dominantní recesivní recesivní dominantní
homozygot homozygot homozygot homozygot
GP XA Xa; Ya Xa XA; YA
F1 XAXa x XAYa XAXa x XaYA
GF1 XA; Xa XA; Ya XA; Xa Xa; YA
F2 XAXA ; XAXa ; XAYa ; XaYa XAXa ; XaXa ; XAYA ; XaYA
Můžeme vidět, že generace F1 je sice v obou případech uniformní a platí i reciprocita parentální generace, ale v generaci F2 je recesivní homozygot stejného pohlaví, u jakého byly obě recesivní vlohy v parentální generaci.
Další důležitou kategorií jsou znaky pohlavně ovládané. Geny, kterými jsou kódované, jsou umístěny na autozomech, ale jejich fenotypový projev je výrazně odlišný v závislosti na pohlaví organismu, ve kterém se nacházejí. Týká se to především určení pohlavního dimorfizmu, jak je tomu v případě sekundárních pohlavních znaků. Jejich genetický základ na autozomech je shodný, ale účinkem hormonální regulační kaskády se fenotypově projeví pouze u jednoho z obou pohlaví.
U člověka (u savců obecně) zůstává u homogametického pohlaví jeden ze dvou chromosomů X spiralizován i v průběhu interfáze. Spiralizace víceméně podmiňuje inaktivaci chromosomu, resp. většiny genů, které jsou na něm umístěny. Inaktivní chromosom je možno pozorovat cytogenetickými mikroskopickými technikami v jádru buňky i během interfáze jako tzv. Barrovo tělísko. Tento jev se nazývá lyonizace.
Na závěr této kapitoly musíme upozornit na zajímavou skutečnost. Způsob chromosomového určení pohlaví u člověka není v přírodě jediný a v průběhu evoluce se vytvořily až tři typy:
- Typ Drosophila je charakteristický pro člověka, savce, většinu druhů rostlin, hmyzu a pro některé druhy ryb a plazů. Má genotypové určení pohlaví XX, XY. Název typu je odvozen od octomilky (Drosophila melanogaster).
- Typ Abraxas je charakteristický tím, že heterogametickým pohlavím jsou samice (XY nebo ZW), zatímco homogametickým pohlavím jsou samci (XX nebo ZZ). Tento typ se vyskytuje především u ptáků a jeho název je odvozen od píďalky angreštové (Abraxas grossulariata).
- Typ Habrobracon je od obou předešlých typů odlišný v tom, že samičí pohlaví je diploidní (2n), zatímco samci mají haploidní genotyp (n). Vyskytuje se u některých druhů společenského hmyzu (např. u včel).
Z hlediska genového určení pohlaví je důležitá lokalizace maskulinních a feminních faktorů. Také v tomto případě rozeznáváme tři typy.
- Typ Drosophila má maskulinní faktory umístěny na autozomech a feminní faktory na gonozomu X.
- Typ Lymantria má feminní faktory lokalizovány na heterochromosomu Y nebo W, přičemž jejich vliv u heterogametického pohlaví převládá nad maskulinními faktory, které jsou lokalizovány na chromosomech X nebo
- Typ Habrobracon má oba typy faktorů - maskulinní i feminní lokalizovány na chromosomu X. O jejich projevu rozhoduje ploidita organismu.
5 Mutace a poškození genetické informace
Variabilita znaků, o které jsme pojednávali v předchozích kapitolách, je podmíněna především přirozenými mechanismy. Patří sem segregace a kombinace alel genů (viz Mendelova pravidla) a rekombinace genů v případě jejich přítomnosti na stejném chromosomu (viz Morganová pravidla). Pro tuto variabilitu je typické, že dochází ke kombinaci alel sledovaných genů, které se samy o sobě nemění.
Kromě této složky variability však známe i jinou možnost zvýšení různorodosti, kterou je změna samotné struktury genetické informace. Někdy se nazývá také jako mutační proměnlivost, která je podmíněna mutabilitou. Pod tímto pojmem rozumíme schopnost genetické informace podléhat trvalým změnám. Mutace tedy můžeme chápat jako změny genotypu, které nejsou podmíněny segregací, kombinací nebo rekombinací.
Literatura:
KING, R.C., STANSFIELD, W.D., MULLIGAN, P.K. A Dictionary of Genetics. Seventh Edition. Oxford University Press, Inc., New York, USA, 2006. 609 s. ISBN 13 978-0-19-530762-7.
BEIGUELMAN, B. A Interpretação Genética da Variabilidade Humana. Brazil, Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, 2008. 152 s.
NEČÁSEK, J., CETL, I. Obecná genetika. Praha: Státní pedagogická nakladatelství, 1979. 565 s. ISBN 1467479.
SRŠEŇ, Š., SRŠŇOVÁ, K. Základy klinickej genetiky a jej molekulárna podstata. Martin: Osveta, 2005. 446 s. ISBN 80-8063-185-9.
5.1 Klasifikace mutací
Prvním kritériem rozdělení mutací je místo jejich vzniku v organismu. Z tohoto pohledu rozdělujeme mutace na somatické, které vznikají v tělních (nepohlavních) buňkách a gametické, které vznikají v prekurzorech pohlavních buněk - gamet. Pouze gametické mutace se mohou pohlavně přenést do dalších generací, somatické mutace se nedědí a zůstávají omezeny pouze na organismus, ve kterém vznikly.
Druhým kritériem je stupeň poškození organismu postiženého mutací. Letální mutace způsobují úmrtí jedince, vitální mutace mohou být pro svého nositele přínosné a neutrální mutace neovlivňují délku života jedince. Uvedené rozdělení je však příliš zjednodušené (příklad 1 – fenylketonurie).
Příklad 1: Fenylketonurie (zkratka PKU). Při tomto onemocnění je nefunkční enzym fenylalanin hydroxyláza (PHA) v důsledku mutace jeho genu, který se nachází na delším raménku chromosomu č. 12 (12q22-24). Nefunkční enzym PHA nedokáže proměnit aminokyselinu fenylalanin na aminokyselinu tyrosin. Důsledkem toho se fenylalanin hromadí v buňkách tkání a poškozuje je. Dochází k těžkému postižení centrálního nervového systému, které se projeví mentální retardací jedince. Dalším projevem onemocnění je hypopigmentace, která vzniká v důsledku zablokované syntézy aminokyseliny tyrosinu. Tyrosin je prekurzorem kožního pigmentu melaninu, odpovědného za zbarvení pokožky. Jde o autozomálně recesivní mutaci, tj. jedinec musí zdědit od obou svých rodičů chromosom č. 12 s nefunkčním genem pro enzym PHA. Z toho logicky vyplývá, že oba rodiče jsou zdraví heterozygoti bez příznaků onemocnění. Proto se provádí u všech novorozenců screeningové vyšetření PKU. Vzhledem k povaze onemocnění je jedinou možnou terapií dieta s radikálním (ovšem ne s absolutním) omezením obsahu aminokyseliny fenylalaninu. Zvláštní pozornost se musí věnovat tzv. maternální fenylketonurii. Jde o graviditu ženy s PKU. Z hlediska minimalizace poškození plodu vysokými koncentracemi fenylalaninu je nutné snížit jeho příjem v potravě matky před i v průběhu těhotenství.
Třetím důležitým kritériem rozdělení mutací je jejich molekulární povaha a rozsah. Z tohoto pohledu se zpravidla mutace rozdělují na genové, chromozomální a genomové. Genové mutace jsou nejmenší svým rozsahem, ne však závažností poškození. Postihují pouze jeden nebo několik málo nukleotidů v DNA. Typickým příkladem genové mutace je již zmíněná fenylketonurie. V případě mutační záměny jediné báze hovoříme o tzv. bodové mutaci. Chromozomální mutace jsou rozsahem větší a zahrnují až tisíce párů bází. Mohou se proto projevit jako strukturální a morfologické anomálie chromosomů, které jsou dobře pozorovatelné v prvních stádiích nepřímého buněčného dělení, především v metafázi mitózy. Počet genů zahrnutých v úsecích změněných mutacemi je větší. Genomové mutace jsou rozsahem největší. V jejich případě dochází ke změnám počtu celých chromosomů, tedy k ovlivnění celkové konstituce genomu organismu.
A) PŘÍKLADY GENOVÝCH MUTACÍ:
Substituce: Jedná se o nahrazení jednoho nukleotidu v sekvenci DNA jiným nukleotidem (příklad 2 – srpkovitá anémie).
Příklad 2: Srpkovitá anemie. V případě syntézy polypeptidového ß-řetězce hemoglobinu A, složeného ze 146 aminokyselin může dojít k mutaci. Tymin je nahrazen (substituován) za adenin, díky čemuž dochází k záměně šesté aminokyseliny. Místo kyseliny glutamové se během translace do polypeptidu zabuduje aminokyselina valin:
Původní gen Mutace
DNA: CAC GTG GAC TGA GGA CTC CTC CAC GTG GAC TGA GGA CAC CTC
GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG GTG CAC CTG ACT CCT GTG GAG
↓ ↓
RNA: GUG CAC CUG ACU CCU GAG GAG GUG CAC CUG ACU CCU GUG GAG
↓ ↓
Protein: Val His Leu Thr Pro Glu Glu Val His Leu Thr Pro Val Glu
Tato jediná záměna nukleotidů způsobuje, že hemoglobin, který obsahuje mutovaný řetězec je mnohem méně solubilní ve srovnání se standardní formou, reprezentovanou hemoglobinem A. Tento efekt je ještě výraznější při nižší koncentraci kyslíku, kdy dochází ke shlukování molekul. Erytrocyty nabývají typický srpkovitý tvar. Výsledek známe jako srpkovitou anémii (falciformní anémie, drepanocytóza). Postižené erytrocyty blokují průtok krve v kapilárách, v důsledku čehož dochází k poškození příslušné tkáně. Dalším projevem onemocnění je anémie.
Důležitá poznámka: Právě srpkovitá anémie je příkladem hodnocení přínosu mutace pro nositele. Na to, aby měl jedinec toto onemocnění, musí být z genetického hlediska recesivní homozygot, který zdědil od rodičů obě mutantní alely. Z tohoto úhlu pohledu je to určitě mutace nevýhodná. Přesto je však hodně rozšířená, především v tropických a subtropických oblastech. Zjistilo se, že zeměpisné rozšíření této mutace se shoduje s oblastmi výskytu malárie. Jedinci, kteří jsou genotypové heterozygotní, jsou odolnější vůči malárii ve srovnání s dominantními homozygoty, kteří ve svém genotypu nesou pouze standardní alely pro ß-řetězec hemoglobinu A. Vidíme, že pokud je mutace v konkrétní alelové kombinaci nevýhodná pro jednotlivce, neznamená to, že je automaticky nevýhodná pro celou populaci. O výhodnosti nebo nevýhodnosti projevu alely tedy primárně nerozhoduje její molekulární forma, ale prostředí, ve kterém se u daného jedince v určité genotypové kombinaci projeví.
Mezi další typy genových mutací patří inzerce, delece a inverze. Na příkladu změn modelové sekvence aminokyselin v hypotetickém proteinu si ukážeme podstatu vlivu uvedených mutací:
A/ Modelová sekvence: B/ Inzerce C/ Delece D/ Inverze
DNA: … TTA CGG ACT… …TTA CAG GAC T… …TTC GGA CT … …TTA GGC ACT…
…AAT GCC TGA… …AAT GTC CTG A… …AAG CCT GA… …AAT CCG TGA…
↓ ↓ ↓ ↓
RNA: …AAU GCC UGA… …AAU GUC CUG A… …AAG CCU GA… …AAU CCG UGA…
↓ ↓ ↓ ↓
Protein: …Asn Ala Stop… … Asn Val Leu … … Lys Pro … … Asn Pro Stop…
A/ Modelová sekvence: Na chromosomu máme úsek DNA, který tvoří sekvence devíti párů bází. Podle sekvence kodogenního řetězce DNA (... TTA CGG ACT ...) se genetická informace přepíše do mRNA. Během translace se podle genetického kódu (Tabulka 1/B) přepíše sekvence tripletů v mRNA do sekvence dvou aminokyselin (asparagin, alanin) v polypeptidovém řetězci. Na tomto místě syntéza polypeptidu končí, protože poslední triplet na mRNA kóduje stop-kodon UGA.
B/ V případě inzerce (vložení) dojde k náhodnému přidání nadbytečného nukleotidu (v tomto případě adeninu). To způsobí přeorganizování následných tripletů čtecího rámce genetického kódu včetně mutací postiženého tripletu. Vidíme, že inzerce adeninu způsobila jednak záměnu původní aminokyseliny alaninu za valin, jednak díky ní zanikl stop-kodon. Proto syntéza polypeptidu bude pokračovat dál, přičemž první "novou" aminokyselinou bude leucin.
C/ V případě delece se z nukleotidové sekvence DNA náhodně vyštěpila třetí báze v pořadí - adenin. Dochází k posunu celého čtecího rámce, místo asparaginu a alaninu jsou do polypeptidu vloženy aminokyseliny lysin a prolin, přičemž zaniká stop-kodon a syntéza polypeptidu bude pokračovat dalším nesmyslným zařazováním nepotřebných aminokyselin do polypeptidového řetězce.
D/ Inverze je otočení několika párů bází v sekvenci. Tato mutace neposouvá čtecí rámec, ale může měnit aminokyselinu. V tomto případě dochází k záměně alaninu za prolin.
Důležité poznámky ke genovým mutacím:
- Místo a typ genových mutací bývá náhodné, ačkoli je fakt, že ne všechny sekvence DNA v genomu člověka podléhají mutačním změnám se stejnou frekvencí.
- Z uvedeného příkladu je vidět nesmírnou důležitost jedné z vlastností genetického kódu - jeho degenerovanosti (viz Tabulka 1/B). Díky existenci několika kombinací tripletů mRNA pro jednotlivé aminokyseliny se vzniklá mutace nemusí nutně projevit (tzv. tichá mutace, z angl. slient mutation).
- Sekvence nukleotidů vzniklá mutací může znovu pod vlivem další mutace nabýt původní stav. Mluvíme o zpětných mutacích, jejichž frekvence je však o několik řádů nižší než frekvence "přímých mutací", čili mutací, které vedly k prvotní změně původního genotypu za mutovaný.
B) Příklady chromozomálních mutací
Chromozomální mutace se také nazývají jako chromozomální aberace. Jsou to strukturní změny chromosomů, jejichž primární příčinou bývá přerušení fosfodiesterové vazby nukleotidů, nazývané také jako zlom. Reparační mechanismy mohou v jádru buňky zlom opravit a docílit buď původní stav (jedná se o tzv. restituci zlomu) nebo pozměněný stav (jedná se o tzv. reparaci zlomu). Ke vzniku chromozomálních aberací může dojít ve všech fázích interfáze buněčného rozmnožování. V užším slova smyslu je rozdělujeme na aberace chromosomové, které vznikají v průběhu G1-fáze a aberace chromatidové, které vznikají v průběhu syntetické fáze nebo G2-fáze.
Mezi chromozomální aberace zařazujeme delece, duplikace, deficience, pericentrické a paracentrické inverze, reciproké a nereciproční translokace, Robertsonské translokace, dále centrické prstencové chromosomy, dicentrické a acentrické chromosomy.
Schémata chromozomálních aberací:
A/ Standardní stav: Uvažujme o chromosomu, na kterém sledujeme 8 genů (M, N, O, P, R, S, T, U), jejich postavení vůči centromeře C a oběma koncům chromosomu - telomerám T. Organismus obsahuje za normálních okolností dva chromosomy, které tvoří homologický chromosomový pár s uspořádáním:
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosomy homologického páru
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T
B/ Delece je ztráta úseku uvnitř chromosomu. Pokud například dojde k deleci genů R, S a T na jednom z chromosomů, nastane následující stav:
T-M-N-O-C-P-V-T + R-S-U deletovaný chromosom + acentrický fragment
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosom
Pokud nastane mutace v G1-fázi, chromosom bude mít postižené obě chromatidy. Pokud nastane mutace po S-fázi, chromosom je již tvořen dvěma kopiemi spojenými centromerou, přičemž bude mít před buněčným dělením poškozenou pouze jednu z obou chromatid (viz obrázek 3 a příslušný text).
Příkladem delecí u člověka jsou syndromy Cri du chat (delece krátkých ramen chromosomu č. 5; výskyt cca. 5 : 100 000) a Wolfův-Hirschornův syndrom (delece krátkých ramen chromosomu č. 4).
C/ Duplikace (obecně multiplikace při vícenásobném zmnožení) je zdvojení (zmnožení) některé části chromosomu:
T-M-M-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T chromosom s triplikací genu M
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosom
D/ Deficience je ztráta části chromosomu včetně centromery. V důsledku toho je takový chromosom nestabilní, protože posláním centromery je mimo jiné také strukturální stabilizace chromosomu.
T-M-N-O-C-P-R chromosom s deletovanými geny S,U, V a centromerou
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosom
E/ Pericentrická inverze je otočení směru lineárního uspořádání genů, které zahrnuje oblast centromery. Na příkladu uvádíme pericentrickou inverzi genů O, P, R a S.
T-M-N-S-R-P-C-O-U-V-T pericentrická inverze
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosom
F/ Paracentrická inverze je lineární otočení směru uspořádání genů, které nezahrnuje centromeru.
T-M-N-O-C-U-S-R-P-V-T paracentrická inverze
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T standardní chromosom
G/ Dicentrický chromosom vzniká tehdy, pokud zlomy vzniknou na obou chromatidách a následně dojde k jejich nesprávnému spojení, takže výsledný chromosom obsahuje dvě centromery. Acentrický chromosom neobsahuje žádnou centromeru.
T-M-N-O-C-P-R-S-P-C-O-N-M-T dicentrický chromosom
T-M-N-R-S-U-V-T acentrický chromosom
H/ Translokace reciproké se týkají dvou různých nehomologních chromosomů. Při reciproké translokaci jsou na obou chromosomech vzájemně vyměněny úseky. Rozsah genetické informace je však nezměněn, proto je tato mutace slučitelná se životem organismu, ve kterém vznikla, u potomstva ovšem může vést k závažnému postižení:
Genotyp rodiče před translokací (standardní stav):
První pár chromosomů Druhý pár chromosomů
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T
Genoyp rodiče po reciproké translokaci:
T-A-N-O-C-P-R-S-E-F-T T-M-B-C-D-U-V-T chromosomy s translokací
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T standardní chromosomy
Genotyp potomka, který zdědí chromosom druhého páru s translokací:
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-M-B-C-D-U-V-T
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T
Výsledek: Možné těžké postižení potomka rodiče s reciprokou translokací, protože geny A, E a F jsou přítomny pouze v jediné kopii na standardním chromosomu, zatím co geny M, U a V (včetně úseku telomery) jsou v organismu potomka přítomny ve třech kopiích jak na chromosomu s translokací, tak na obou standardních homologických chromosomech prvního páru.
Příkladem reciproké translokace u člověka je tzv. Filadelfský chromosom. Jde o reciprokou translokaci mezi chromosomy č. 9 a č. 22. Dochází přitom k fúzi genu BCR s genem abl, který je protoonkogen. V důsledku toho dochází k nekontrolovanému dělení buněk. Proto tuto mutaci často nacházíme při vyšetření pacientů s chronickou myeloidní leukémií.
I/ Nereciproké translokace jsou nevyvážené chromosomové přestavby. Jsou nebezpečné i pro nositele, u kterého tyto aberace vznikly:
T-M-N-O-C-P-R-S-A-B-C-D-E-F-T + T-A-U-V-T nereciproká translokace + acentrický fragment
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T standardní chromosomy
J / Robertsonské translokace vznikají fúzí chromosomů v místě příčně rozštěpených centromer:
T-M-N-O-C-D-E-F-T T-A-B-C-P-R-S-U-V-T Robertsonská translokace
T-M-N-O-C-P-R-S-U-V-T T-A-B-C-D-E-F-T standardní chromosomy
K / Prstencové (ring) chromosomy nemají telomery a oba konce jsou spojeny tak, že vytvoří kružnicový útvar.
Všechny uvedené chromozomální aberace představují zásadní problém, protože dochází k přestavbě genetického materiálu, čímž se zvyšuje riziko postižení potomstva. Chromosomy s aberacemi nejsou schopny dokonalého homologního párování v průběhu mitózy a meiózy, protože se liší od standardního uspořádání chromosomu. V případě chromosomů bez centromery (acentrických) dochází v průběhu buněčného dělení k nevratné ztrátě genetické informace, protože právě centromera zaručuje správný přenos obou kopií chromosomů s pomocí dělícího aparátu do dceřiných buněk.
V současnosti je u člověka známo několik stovek klinických syndromů, které jsou způsobeny chromozomovými aberacemi. Jejich závažnost závisí na rozsahu aberace a její lokalizace na konkrétním chromosomu.
C) Příklady genomových mutací
Genomové mutace jsou co do rozsahu nejrozsáhlejší a postihují počty celých chromosomů. Podle toho se dělí na tzv. polyploidie a aneuploidie. U polyploidií se mění počty chromosomů o celý násobek základní haploidní sady. Např. u člověka by to bylo 46 +23, 46 +23 + 23, atd. Z hlediska nomenklatury se polyploidie se sudým násobkem chromosomů nazývají jako ortoploidie, s lichým násobkem chromosomů se jedná o anortoploidie. Vzhledem ke svému obrovskému rozsahu se u člověka systémově nevyskytují a jsou neslučitelné se životem. Může však dojít k zablokování buněčného dělení somatických buněk po S-fázi, tedy ve stavu 2N, 4C (viz kapitola 4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk). Taká buňka je v podstatě tetraploidní. U somatických buněk člověka se s tímto jevem setkáváme hlavně při regeneračních procesech v některých tkáních (játra). V značné části případů je však tento stav předstupněm deregulace buněčného dělení a s tím spojené karcinogeneze.
Aneuploidie je u člověka častější. V případě nadbytečného chromosomu mluvíme o trizomii, pokud chromozom chybí, jde o monozomii. Vitální trizomie u člověka známe pouze tři: Downův syndrom (trizomie chromosomu č. 21), Edwardsův syndrom (trizomie chromosomu č. 18) a Pataův syndrom (trizomie chromosomu č. 13). Slovo "vitální" však neznamená, že všechny plody se zmíněnými trizomiemi se mohou vyvinout a přijít na svět. Např. u Patauova syndromu se z plodů postižených poruchou narodí pouze asi 1 %, přičemž mortalita novorozenců s touto vývojovou anomálií vysoce převyšuje 80 %. Monozomie autozomů u člověka nejsou slučitelné se životem. U gonozomů známe trizomie chromosomů X i Y. Jde o Klinefelterův syndrom (karyotyp 47,XXY nebo vzácněji tetrazomie 48,XXXY; (příklad 3 – „myšlení v genetických souvislostech“) a syndromy supermale (karyotyp 47,XYY) a superfemale (karyotyp 47,XXX). Monozomie, které by měly pouze chromosom Y bez chromosomu X, nejsou slučitelné se životem. Monozomie chromosomu X se nazývá Turnerův syndrom (karyotyp 45,X; příklad 4 - „myšlení v genetických souvislostech“). Společným znakem všech vitálních trizomií i monozomií u člověka je mnohočetnost postižení, časté metabolické poruchy, snížená fertilita, snížení mentálních schopností jedince a v případě gonozomů i výraznější změny ve stavbě sekundárních pohlavních znaků.
Příklad 3. Klinefelterův syndrom je karyotypově charakterizován trizomií gonozomů díky nadbytečnému chromosomu X. Karyotyp pacienta zapisujeme jako: 47,XXY (na rozdíl od zdravého muže, jehož karyotyp je: 46,XY). Klinicky se jedná většinou o jedince s hypogonadismem (snížená funkce pohlavních žláz), u nichž může být přítomna gynekomastie (benigní zduření prsní žlázy) a nižší koncentrace testosteronu. Je zajímavé, že za určitých podmínek můžeme určit i to, u kterého z rodičů došlo k vzniku mutace a dokonce i to, zda se tak událo v prvním nebo druhém meiotickém dělení při tvorbě gamet. Pokud máme např. pacienta s Klinefelterovým syndromem, který má protanomálii (oslabené vidění červené barvy, je to mírná forma daltonizmu vázaného na chromosom X) a oba jeho rodiče jsou zdraví, je zřejmých několik faktů:
· Od otce dostává syn za normálních okolností pouze chromozom Y, od matky X. Otec v tomto případě nemohl poskytnout spermii, která by obsahovala oba jeho gonozomy X a Y, protože je na rozdíl od syna zdravý a nemá protanomálii.
· Matka dává za normálních okolností synovi pouze jeden chromozom X. Pokud ovšem dojde k nondisjunkcii (nerozdělení) chromatid během druhého meiotického dělení (viz obrázek 3), její vajíčko bude obsahovat místo jednoho chromosomu X chromosomy dva. Taková situace může nastat, pokud se centromera chromosomu během druhého meiotického dělení (viz kapitola 4.1) neroztrhne a obě identické kopie chromosomu (chromatidy) se dostanou do jediné gamety.
Z uvedených výsledků proto vyplývá, že matka pacienta je přenašečka XDXd, u níž nedošlo k nondisjunkcii obou chromatid chromosomu Xd v průběhu druhého homeotypického meiotického dělení. V důsledku toho její syn zdědil oba chromosomy Xd s mutovanou alelou, přičemž jeho genotyp pro sledovaný znak je: XdXdY. Genotyp jeho otce je XDY a na postižení svého syna nemá tudíž z genetického hlediska žádný podíl.
Příklad 4. Enzym glukóza 6-fosfát dehydrogenáza (G-6PDH) je zahrnut v pentosafosfátovém cyklu. Jeho přítomnost je důležitá hlavně v erytrocytech. V případě deficience G-6PDH dochází k hemolytické anémii. U jedinců se projevuje tzv. favismus - hemolýza po požití bobů (z lat. faba - bob). Gen pro G-6PDH se nachází na delším raménku chromosomu X, na pozici Xq28. Kromě této recesivní alely můžeme v populaci zjistit produkty několika dalších normálních a funkčních alel genu G-6PDH, které jsou označovány jako B, A a A-. Dají se rozlišit laboratorním vyšetřením. Dále uvažujme o holčičce s Turnerovým syndromem (45,X; karyotyp normální ženy je: 46,XX), která má jeho typické projevy: hypogonadismus, anomálie ledvin, lymfedémy. Laboratorním vyšetřením děvčátka se zjistilo, že má enzymovou variantu G-6PDH B (genotyp XB--). Vyšetření rodičů ukázalo, že matka holčičky je v případě genu pro G-6PDH homozygot XBXB, otec má genotyp XAY. Z laboratorních zjištění je zřejmé, že jediný chromosom pacientky s Turnerovým syndromem pochází od matky. K mutaci proto muselo dojít v průběhu gametogeneze u jejího otce, od kterého nedostala chromosom, který podle pravidel dědičnosti dostat měla: chromosom X s alelou G-6PDH A. V tomto případě však není možné určit, zda byla mutace důsledkem nondisjunkcie v prvním nebo druhém meiotickém dělení.
Na příkladech 3 a 4 jsme si vysvětlili nondisjunkcii chromosomů během meiotického dělení jako prvotní příčinu postižení jedince. Nondisjunkcí tedy rozumíme nerozdělení homologních chromosomů v průběhu heterotypického meiotického dělení anebo nerozdělení obou sesterských chromatid v průběhu homeotypického meiotického dělení. Tento jev se však může vyskytnout i v případě mitózy na somatické úrovni. Pokud k mitotické nondisjunkcii dojde v časných stádiích embryogeneze, postižený jedinec je tvořen dvěma (případně i více) liniemi buněk s různým karyotypem. Tento jev se nazývá mozaicismus a vyskytuje se jak u trizomií (např. u Downova syndromu) tak monozomií (Turnerův syndrom). Výsledný projev mozaicismu však není jednotný, ale má značnou variabilitu, která závisí od doby vzniku mutace v průběhu ontogenetického vývoje jedince a typu buněčných linií.
U člověka je zcela vzácným jevem tzv. chimérismus. V tomto případě je jedinec na buněčné úrovni tvořen liniemi buněk, které pocházejí ze dvou různých zygot. Takové případy jsou však extrémně raritní.
Mutace však nenacházíme pouze v jádru, ale i v semiautonomních organelách - mitochondriích. Kromě bodových mutací tam můžeme zjistit i odchylky v počtu kopií mtDNA, především snížení její počtu - tzv. deplece DNA. Tento případ se označuje jako mtDNA depleční syndrom (MDDS) a zahrnuje symptomaticky heterogenní skupinu mitochondriálních dysfunkcí s následným postižením různých tkání a orgánů.
Musíme si uvědomit fakt, že v buňce není jediná mitochondrie ale stovky až tisíce, přičemž mutace nemusí být stejná u všech. V tomto případě mluvíme o heteroplazmii. Homoplazmie označuje stav, kdy jsou v buňce přítomny mitochondrie se shodnou genetickou informací.
Musíme si uvědomit fakt, že v buňce není jediná mitochondrie ale stovky až tisíce, přičemž mutace nemusí být stejná u všech. V tomto případě mluvíme o heteroplazmii. Homoplazmie označuje stav, kdy jsou v buňce přítomny mitochondrie se shodnou genetickou informací.
5.2 Mutagenní faktory
Názorným příkladem pro pochopení přirozeného vzniku genových mutací a působení reparačních mechanismů může být přirovnání DNA a její funkce (rozplétání při replikaci nebo transkripci) k zipu. Při nošení oděvu se sice vzácně, ale přece jen stane, že při zapínání zipu se v běžci omylem spojí dva zoubky z jedné strany do mezery pro jediný zoubek na protější straně. V takovém případě sice můžeme pokračovat v zapínání zipu až do konce, ale pokud to zjistíme, vrátíme se s běžcem zpět a uvolníme chybný spoj. Přesně toto je principem vzniku genových mutací i působení reparačních mechanismů, které s tím úzce souvisí. Okolnosti přirozeného vzniku chromozomálních a genomových mutací jsou složitější.
Faktory vnějšího prostředí, které jsou schopny ovlivnit genetickou informaci a vyvolat vznik mutací, se nazývají mutageny. V případě, že reparační mechanismy (viz kapitola 5.3) nejsou schopny opravit změny a poškození nukleových kyselin po působení mutagenů, změna se stává integrální součástí genotypu jedince. Z hlediska míry intenzity působení vnějších faktorů na genotyp rozdělujeme mutace na spontánní a indukované. Spontánní mutace vznikají přirozeně, přičemž jejich frekvence je nízká. Frekvence fenylketonurie (bodová, genová mutace) činí asi 1 : 6000. Z genomových mutací se frekvence trizomie chromosomu č. 21 (Downův syndrom) u člověka vyskytuje v poměru 1: 700, trizomie chromosomu č. 13 má frekvenci 1:10000. Indukované mutace vznikají po intenzivnějším (a cíleném) vystaveni organizmu působení mutagenů. Mutageny rozdělujeme na fyzikální, chemické a biologické.
Mezi fyzikální mutageny řadíme všechny druhy vlnění, které mají prokazatelný účinek na genetický materiál organismu. Nejčastěji sem řadíme ionizující záření, které způsobuje chromozomální zlomy a UV záření, které sice neproniká hlouběji do organismu, ale může způsobovat změny na úrovni bází v epitelových buňkách pokožky. Jeho působením dochází mezi sousedícími pyrimidinovými bázemi (cytosin, tymin) ke vzniku kovalentních vazeb mezi jejich atomy uhlíku a vytvoření tyminových nebo cytosinových dimerů. Takový útvar představuje překážku pro enzymové komplexy během replikace.
Chemické mutageny představují obrovskou skupinu chemických sloučenin. Chemický průmysl vyprodukuje ročně stovky chemických látek, které jsou potencionálními mutageny. Příkladem chemických mutagenů jsou kyselina dusitá, akridinová barviva, alkylační látky, polychlorované bifenyly (PCB), bojové látky (např. yperit) apod. Výzkum mutagenity chemických látek nesmírně ztěžuje fakt, že v organismu jsou metabolizovány na další molekuly. Proto primární molekula nemusí být mutagenem, kterým se stává až její následný metabolit. Taková látka se nazývá premutagen (např. polycyklické aromatické uhlovodíky).
Mezi biologické mutageny řadíme viry, které jsou schopny včlenit se (inkorporovat) do genomu buňky hostitelského organismu. Při tomto procesu může dojít k narušení regulačních mechanismů genové exprese. Příkladem je virus HIV. Jde o tzv. retrovirus, tedy virus, který má genetickou informaci uloženou v RNA. Po vniknutí do buňky se jeho genom přepíše s pomocí enzymu reverzní transkriptáza do DNA, která se může včlenit do genomu buňky hostitele.
Na závěr této kapitoly je třeba zdůraznit, že musíme jasně rozlišovat mezi pojmy „mutagenní“, „karcinogenní“ a „teratogenní“. Ne všechny mutageny patří ke karcinogenům, tedy k látkám, které spouštějí vícestupňový proces, vedoucí k maligní transformaci buněk a rozvoji nádorového onemocnění u daného jedince. Mutagen má v případě zasažení pohlavních buněk vliv i na následující generace. V protikladu s mutagenem způsobuje teratogen během těhotenství poškození plodu, které není geneticky podmíněné, ale svým klinickým projevem je velmi podobné s genetickou poruchou. V případě, že toto poškození dovolí postiženému jednotlivci dosáhnout reprodukční věk, nemůže se přenést na generaci jeho potomstva. Je totiž pouze imitací vlivu mutace, kterou nazýváme fenokopie. Pojem vrozená vývojová vada tedy znamená, že dítě se narodilo s určitým poškozením a až genetické vyšetření může potvrdit, zda se jedná o mutaci nebo o fenokopii, která vznikla působením teratogenu.
5.3 Reparační mechanismy
Úkolem reparačních systémů je zajistit úplnou nebo alespoň částečnou opravu poškození DNA. Jde o enzymové systémy, které odstraňují důsledky působení látek poškozujících nukleové kyseliny (mutagenů) a chyb, které vznikly v průběhu replikace nebo rekombinace.
Na odstraňování pyrimidinových dimerů slouží fotoreaktivace. Při ní dochází k aktivaci enzymu fotolyáza působením světla s vlnovou délkou 340 - 400 nm a následnému odstranění dimeru. Druhou skupinou reparačních dějů jsou tzv. excizní reparace. Během nich dochází k odstranění poškozených úseků DNA a k opětovné syntéze správné varianty sekvence nukleotidů. Třetí skupinou významných opravných mechanismů jsou tzv. tolerantní reparace. V případě jednořetězcového poškození obnovují původní funkci tak, že neopravují vlastní poškození, ale během replikace se koriguje poškození v novém komplementárním řetězci.
Důležitá poznámka: Mutace genů, jejichž produkty jsou zahrnuty do reparačních mechanismů, patří mezi nejzávažnější. Patří sem např. Xeroderma pigmentosum, Bloomův syndrom nebo Weber - Cockayneov syndrom. Zmíněná onemocnění jsou autozomálně recesivní poruchy, při nichž je vysoká frekvence vzniku zhoubných novotvarů.
6 Populační genetika
6.3 Testovací otázky
V předchozích kapitolách jsme se zabývali genetikou na úrovni jednotlivců. Připomínáme, že soubor všech genů organismu se nazývá genotyp a výsledný projev genotypu ovlivňován vnějším prostředím se nazývá o fenotyp (kapitola 2.3). Podle toho, jaký genotyp měli rodiče, bylo možné předpovědět statistickou pravděpodobnost genotypů potomstva. Pokud jsme měli rodiče s krevní skupinou A, kteří byli ve sledovaném znaku heterozygoti IAi, bylo nám jasné, že z hlediska genotypů můžeme očekávat u jejich dětí ¼ dominantních homozygotů IAIA, ½ heterozygotů IAi a ¼ recesivních homozygotů ii. Fenotypově bude mít potomstvo statistickou pravděpodobnost krevní skupiny A vůči 0 v poměru 3:1.
Zkusme si však výše uvedenou situaci rozšířit z příkladu jedné rodiny na celou skupinu jedinců. V dané lokalitě mohou žít tisíce mužů i žen s různými genotypy, kteří své alely odevzdávají svému potomstvu, u nějž se tyto rodičovské alely opět vyskytují v určitých kombinacích - genotypech.
Celý následující text se bude vztahovat na genetické vlastnosti populací. Pod pojmem populace z hlediska této studijní opory rozumíme skupinu jedinců stejného, pohlavně se rozmnožujícího druhu, kteří žijí ve stejném čase na stejném místě a sdílejí společný genofond. Genofond je soubor všech genů, které se nacházejí v populaci sledovaného druhu. Vidíme, že uvedeným definicím odpovídají i populace člověka. Je to příklad tzv. alogamické populace, která je tvořena pohlavně se rozmnožujícími jedinci. V rozsahu této studijní opory se nebudeme zabývat populacemi autogamickými. Ty jsou tvořeny jedinci stejného druhu, kteří žijí ve stejném čase na stejném místě, ale rozmnožují se autogamií (samooplozením).
Důležitou vlastností alogamické populace, která zajímá genetiky i případě sledování populace člověka, je míra přítomnosti panmixie. O panmixii v populaci mluví tehdy, pokud platí, že pravděpodobnost splynutí gamet kteréhokoliv jedince jednoho pohlaví s gametami jedince opačného pohlaví je stejná pro všechny jedince. Můžeme s jistou dávkou zjednodušení konstatovat, že také v případě sledování populací člověka je panmixie víceméně přítomna.
Důležité je uvědomit si, že celková početnost populace nemusí mít z genetického hlediska výpovědní hodnotu, protože zahrnuje jak juvenilní jedince (před pohlavní zralostí), tak staré jedince v postreprodukčním věku a např. i sterilní jedince. Proto se používá pojem efektivní velikost populace. Je to součet všech jedinců, kteří jsou reprodukčně způsobilí. Pouze tito jedinci mají možnost ovlivňovat další generace a tím se podílet na ovlivňování genofondu celé populace. Tím se dostáváme k druhé alternativě chápání pojmu "genofond": je to soubor všech genů v gametách, jejichž splynutím vzniknou zygoty jedinců následující generace.
Poznámka. U člověka se sled generací na populační úrovni prolíná, protože u něj neexistuje sezonalita v rozmnožování, jako např. u jiných druhů zvířat nebo ptáků. Proto nelze na populační úrovni určit jedinou generaci, jako to můžeme například učinit u stěhovavého ptactva. Průměrná generační doba je u člověka přibližně 20 - 25 let.
6.1 Kvalitativní znaky v populaci
Na začátku této kapitoly musíme přiznat, že její název je tak trochu zavádějící, protože si na kvalitativních znacích vysvětlíme jevy v populační genetice. Představme si situaci, že máme gen na autozomu, který má v populaci dvě varianty - alely. Označíme je: A pro dominantní alelu, a pro recesivní alelu. Předpokládejme, že můžeme odlišit heterozygota Aa od dominantního homozygota AA (je jedno, jestli fenotypově nebo laboratorním vyšetřením, jako např. v případě krevních skupin). Dále předpokládejme, že populace je panmiktická.
Pokud sledujeme četnost (frekvenci) alel v gametách, z nichž vzniká nová generace, zjistíme, že panmiktické populace mají tendenci dosáhnout určitý rovnovážný stav. Platí, že ve velké panmiktické populaci (také u člověka) se genové a genotypové frekvence z generace na generaci nemění a zůstávají konstantní. Názorně to ukazuje tabulka 4. Genové četnosti sledovaných alel v gametách označíme symboly p pro dominantní alelu A a q pro recesivní alelu a. Genotypové četnosti jsou tvořeny součinem genových četností. Splynutím gamet opačného pohlaví s alelami A vznikají v generaci potomků dominantní homozygoty AA, přičemž pro jejich početnosti platí: p · p = p2. Obdobně vznikají recesivní homozygoti aa: q · q = q2. Pokud splynou gamety, které obsahují různé alely, vzniknou heterozygoti, kteří statisticky tvoří polovinu kombinačních možností populace: (p · q) + (p · q) = 2pq (tabulka 4).
Tabulka 4 Alelové a genotypové četnosti v populaci
Četnosti:
|
A
p |
a
q |
A
p
|
AA
p2
D |
Aa
pq
H |
a
q
|
Aa
pq
H |
aa
q2
R |
Legenda: modrá barva – četnosti alel (genové) v gametách, červená barva – genotypové četnosti další generace, žlutá barva označení absolutních četností: D – dominantní homozygoti, H – heterozygoti, R – recesivní homozygoti.
Dostáváme rovnici, která se podle svých tvůrců nazývá Hardy-Weinbergova rovnovážná rovnice panmiktické populace:
(p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1 (1)
Genové (alelové) frekvence:
p – frekvence dominantní alely A v populaci
q – frekvence recesivní alely a v populaci
Genotypové frekvence:
p2 – frekvence dominantních homozygotů AA v populaci
2pq – frekvence heterozygotů Aa v populaci
q2 – frekvence recesivních homozygotů aa v populaci
Tato rovnice je matematickým vyjádřením rovnovážného stavu panmiktických populací. Je logické (podle tabulky 4), že genové frekvence p a q dostaneme odmocněním frekvencí genotypových p2 a q2.
Oba sledované parametry (genové i genotypové) se mohou udávat v relativních četnostech (jejich součet je roven 1) nebo v absolutních četnostech, které udávají celkový počet jedinců N. Jak můžeme vidět, Hardy-Weinbergova rovnice pracuje s relativními četností, protože jejich součet je roven 1. Absolutní četnosti genotypů jsou označeny v tabulce 4 symboly D pro dominantní homozygoty, H pro heterozygoty a R pro recesivní homozygoty. Jejich součet je roven celkovému počtu jedinců N:
D + H + R = N (2)
Absolutní genové frekvence můžeme získat, pokud si uvědomíme, že alely se vyskytují ve dvou kopiích u homozygotů a v jedné kopii u heterozygotů. Proto frekvenci dominantní alely A a recesivní alely a vypočítáme podle vztahů:
p = (2D + H)/2N (3)
q = (2R + H)/2N (4)
V jmenovateli je dvojnásobek počtu všech jedinců populace, protože každý jedinec obsahuje dvě alely pro sledován gen (viz. diploidní stav, kapitola 4).
Ne každá populace je vzhledem k sledovaným genům v genetické rovnováze. Jinými slovy, pokud zjistíme genové (alelové) frekvence a dosadíme je do vztahu (1), dostaneme podle uvedeného vzorce jiné četnosti genotypů, než jaké v skutečnosti najdeme v populaci. V takovém případě říkáme, že teoreticky očekávané četnosti genotypů se liší od zjištěných četností, které jsme zjistili přímým vyšetřením populace. Existuje několik faktorů, které významným způsobem mohou narušovat genetickou rovnováhu v populaci. Jsou to: mutace, migrace, selekce a genetický drift.
Mutace mohou měnit genetické parametry populace v případě, že nejsou letální a není výrazně ovlivněna reprodukční schopnost jednotlivců (tzv. fitness), kteří je obsahují ve svém genotypu.
Selekce může výrazně ovlivnit genetickou strukturu populace tehdy, pokud se vytváří selekční tlak vůči některému z genotypů. Platí, že nevýhodnost alely pro jednotlivce (např. v recesivním stavu) ještě nemusí znamenat její nevýhodnost pro celou populaci (viz příklad srpkovité anémie, kapitola 5.1, příklad 2).
Migrace významně ovlivňuje genetickou strukturu populace tehdy, pokud je intenzivnější výměna jedinců (z hlediska genetiky "genotypů") mezi populacemi s různou frekvencí alel sledovaných genů. Migrační procesy se přirozeně rozdělují na emigraci a imigraci.
Posledním faktorem vlivu je tzv. genetický drift, vlivem kterého dochází k náhodným posunům ve frekvenci jednotlivých alel sledovaných genů v populaci. Lze jej pozorovat např. při málopočetných populacích, nebo velkých populacích, rozdělených do menších subpopulací (např. geografickou izolací - vysoké pohoří, vzdálené ostrovy apod.) nebo nestejnoměrnou proporcionalitou zastoupení obou pohlaví v populaci. Právě zde zdůrazňujeme význam pojmu efektivní velikost populace, který v užším slova smyslu bere v úvahu i jiné důležité parametry kromě celkové četnosti jedinců.
Výše uvedené teoretické poznatky si nyní prakticky vysvětlíme na příkladu faktoru V Leiden. Faktor V (proakcelerin) je protein koagulační dráhy, který má důležitou roli v procesech hemostázy a při formování krevní sraženiny. Gen F5, který ho kóduje, se nachází na delším raménku chromosomu č. 1, lokace 1q23. Faktor V se produkuje hlavně v játrech, přičemž v krvi cirkuluje v neaktivní formě. K jeho aktivaci dochází např. při poškození cévy, kdy působením koagulačního faktoru Xa se aktivuje na aktivní faktor Va. V dalším sledu se může vlivem těchto faktorů konvertovat neaktivní protrombin na aktivní trombin, který spouští tvorbu fibrinu, důležitou při formování krevní sraženiny.
Autozomálně dominantní mutace v nukleotidové sekvenci genu v pozici 1691 má za následek záměnu bází, konkrétně G→A. V důsledku toho dochází k substituci původní aminokyseliny argininu v pozici polypeptidového řetězce č. 506 za aminokyselinu glutamin. V důsledku toho se stává aktivní faktor V rezistentní na aktivovaný protein C (APC), jehož úkolem je mimo jiné regulovat míru celkové aktivity faktoru FV tím, že ho inaktivuje štěpením na přesně určeném místě. Uvedená mutace (nazvaná podle města svého objevu v roce 1994 jako Leidenská) však záměnou aminokyselin toto štěpení znemožní, čímž se snižuje míra kontroly FV s pomocí APC. Proto proces tvorby sraženiny trvá déle, než je potřeba. Kromě toho se zvyšuje riziko tvorby abnormálních krevních sraženin. Mluvíme proto o tzv. hyperkoagulabilních stavech. Proto je tento parametr z hlediska hematologů velmi důležitý, protože v případě kardiovaskulárních příhod lze laboratorně určit, zda pacient má Leidenskou mutaci (příp. i důležité mutace jiných koagulačních faktorů) nebo ne. Tím se může upřesnit vliv vnějších faktorů na vznik onemocnění (stres, kouření, etylismus, orální kontraceptiva apod.) a s ohledem na genetickou konstituci pacienta se zvolí nejoptimálnější strategie terapie.
Předpokládejme, že v rámci testování vyšetříme za dané časové období 2000 pacientů, z nichž 1500 bude homozygotů GG s oběma zdravými alelami (D), které obsahují v místě 1691 guanin. 450 jedinců bude heterozygotních (H) s genotypem GA, protože budou obsahovat jednu zdravou alelu a jednu mutantní alelu. Nakonec budeme mít 50 jedinců, kteří budou homozygotní (R) pro mutantní alelu AA. Naším úkolem je ověřit, zda v populaci existuje genetická rovnováha ve smyslu Hardy-Weinbergova zákona. V případě, že by genetická rovnováha přítomna nebyla, znamenalo by to přítomnost rušivých faktorů, jako např. selekce vůči nositelem mutantní alely, jejich nižší reproducibilita a pod.
Protože známe počty všech tří genotypů v populaci, můžeme si v prvním kroku vypočítat genové frekvence obou alel. Kvůli zjednodušení si je označme jako G pro standardní alelu a A pro mutantní alelu. Po dosazení do vztahů (3) a (4) dostáváme následující relativně genotypové četnosti obou alel:
pG = (2D + H)/2N = (2 · 1500 + 450)/4000 = 3450/4000 = 0,8625 (86,25%)
qA = (2R + H)/2N = (2 · 50 + 450)/4000 = 550/ 4000 = 0,1375 (13,75%)
D = 1500 (GG)
H = 450 (GA)
R = 50 (AA)
N = 2000 (GG + GA + AA)
Všimněte si, že máme sice 2000 pacientů, ale každý z nich obsahuje dvě alely pro sledovaný gen FV. Proto je celkový počet alel dvojnásobný vůči celkovému počtu jedinců, tj. činí 4000 alel. Absolutní četnost zdravé alely G představuje 3450, což odpovídá relativní četnosti 0,8625. Jinými slovy, z celkového počtu 4000 alel je 86,25% zdravých alel G, což v absolutních počtech činí 3450 alel. Z nich se 3000 nachází u homozygotů GG a 450 u heterozygotů GA. Relativní frekvence recesivní alely A činí 0,1375. Jinými slovy, ze 4000 alel je 13,75% recesivních alel A, což v absolutních číslech představuje 550 alel. Z nich se 100 vyskytuje u homozygotů AA a 450 u heterozygotů GA. Součet relativních frekvencí všech alel je roven jedné, jak to vyplývá z levé strany vztahu (1) : (0,8625 + 0,1375)2 = 1.
Poznámka: Uvedené číselné hodnoty genových frekvencí jsou v intervalu reálného numerického rozsahu, který lze zjistit vyšetřením jedinců kaukazoidní rasy ve střední Evropě.
V druhém kroku si na základě získaných genových frekvencí ověříme, zda v populaci pacientů existuje genetická rovnováha, při které se genové i genotypové početnosti z generace na generaci nemění. Po dosazení do vztahu (1) dostáváme následující relativně genotypové frekvence:
p2 + 2pq + q2 = 1
↓
(0,8625)2 + 2(0,8625 · 0,1375) + (0,1375)2 = 1
↓
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
Zjistili jsme, že relativní frekvence zdravých homozygotů GG představuje 74,4%, heterozygoti GA s jednou mutantních Leidendskou alelou jsou zastoupeni v 23,7% a recesivních homozygotů AA s oběma mutantními alelami je pouze 1,9% z celkového počtu. Všimněte si prosím, že součet relativních četností ve třetím řádku výpočtu se opravdu rovná jedné a součet procentuálního zastoupení všech alel je rovný 100%.
Teoreticky očekávané absolutní genotypové četnosti, které by měly být přítomny v testované populaci v případě genetické rovnováhy, získáme tak, že relativně genotypové četnosti, získané podle vztahu (1) vynásobíme celkovým počtem jedinců N (2000 pacientů):
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
↓ x 2000
1488 + 474 + 38 = 2000 Teoreticky očekávané genotypové četnosti
↕ ?? – testování shody s pomocí statistických testů
1500 + 450 + 50 = 2000 Zjištěné reálné genotypové četnosti
D + H + R = N
Vidíme, že ačkoliv se číselné hodnoty očekávaných i pozorovaných genotypových četností pro sledovaný gen F5 přesně neshodují, jsou vzájemně pro jednotlivé genotypy podobné. Na základě toho můžeme konstatovat, že námi vyšetřena populace pacientů je pro sledován gen F5 v genetické rovnováze. Jinými slovy, neexistují významné rušivé vlivy typu mutací, selekce nebo migrace, které by genetickou rovnováhu v populaci narušovaly.
Poznámka: Existují statistické testy, kterými můžeme exaktně testovat rozdíly mezi očekávanými a pozorovanými četností a jejich statistickou významnost. V tomto případě lze použít např. chí-kvadrátový test (pouze pro úplnost informace: hladina významnosti výsledku tohoto statistického testu pro výše uvedený případ činí p = 0,07 při dvou stupních volnosti). Uvedené poznatky však přesahují rozsah a určení této studijní opory, proto se jim nebudeme věnovat. Bližší informace lze získat v příslušných učebnicích biostatistiky.
Poslední, ale zásadní otázka, kterou si můžeme položit, zní: V jakém případě by genetická přítomnost rovná nebyla? Při vysvětlení odpovědi na ni si pomůžeme předešlým příkladem. Pokud si pozorně spočítáme počet zdravých alel G a mutantních alel A v předchozím příkladu u očekávaných genotypových frekvencí (červeně) a také u pozorovaných frekvencí (černá barva), budou v obou případech stejné. Zjistíme 3450 zdravých alel G a 550 mutantních alel A. Jinými slovy, genové frekvence jsou stejné, ale drobné změny byly v genotypových frekvencích.
Nyní si představme hypotetickou (v reálném světě málo pravděpodobnou) situaci, že bychom v jiné skupině pacientů zjistili přítomnost 1725 homozygotů GG a 275 homozygotů AA. Nezjistili bychom ani jediného heterozygota GA. Vtip je v tom, že genové frekvence má tato hypotetická skupina shodné z předchozí reálnou populací pacientů, ovšem genotypové frekvence jsou zcela odlišné. I bez použití statistických testů můžeme vidět, že v tomto případě není přítomna genetická rovnováha. Skupina pacientů se velmi výrazně liší v genotypových frekvencích od očekávaných hodnot:
D = 1725 (GG)
H = (GA)
R = 275 (AA)
N = 2000 (GG + AA)
Genové frekvence:
pG = (2D + H)/2N = (2 · 1725 + 0)/4000 = 3450/4000 = 0,8625 (86,25%)
qA = (2R + H)/2N = (2 · 275 + 0)/4000 = 550/ 4000 = 0,1375 (13,75%)
Ověření genetické rovnováhy:
p2 + 2pq + q2 = 1
↓ ↓
(0,8625)2 + 2(0,8625 · 0,1375) + (0,1375)2 = 1
↓
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
↓ x 2000
1488 + 474 + 38 = 2000 Teoreticky očekávané genotypové četnosti
↕
1725 + + 275 = 2000 Zjištěné genotypové četnosti v druhé skupině pacientů
Na závěr této kapitoly si zopakujme nejdůležitější aspekty sledování kvalitativních znaků v populaci:
· Důležitým předpokladem genetické stability populace je panmixe a nepřítomnost procesů, které ji narušují (migrace, mutace, selekce).
· Při splnění výše uvedených předpokladů má alogamická populace tendenci stabilizovat genové a genotypové četnosti z generace na generaci.
· Tato stabilita je matematicky vyjádřena rovnicí, nazývanou Hardy-Weinbergův zákon.
· Platnost Hardy-Weinbergova zákona pro konkrétní sledovanou populaci se ověřuje s pomocí statistických testů (např. chí-kvadrátovým testem). Podle číselné hodnoty hladiny významnosti výsledku těchto testů (označovanou zkratkou "p") lze posoudit rozdíl mezi pozorovanými četnostmi a teoreticky očekávanými četnostmi genotypů.
· Teoreticky očekávané genotypové četnosti získáme dosazením zjištěných genových četností do Hardy-Weinbergova vztahu.
· V případě, že v populaci platí Hardy-Weinbergův zákon (čili v populaci je genetická rovnováha pro sledovaný gen), lze odmocněním genotypových frekvencí p2 a q2 získat genové frekvence p a q. Pokud ovšem v populaci genetická rovnováha není, výše uvedeným způsobem se relativní genové frekvence odvodit nedají resp. odmocněním uvedených číselných hodnot dospějeme k nesprávnému výsledku.
· Pro posouzení, zda je populace v genetické rovnováze může pomoci vztah:
H/√(D ∙ R) = 2 (5)
Čím výraznější je rozdíl výsledku od čísla 2, tím více se populace odchyluje od rovnovážného stavu pro sledovaný gen.
· Hardy-Weinbergův zákon platí i v případě většího počtu alel sledovaného genu. Např. pro krevně-skupinový systém ABO (viz tabulka 2, kapitola 4.3) platí rovnice, rozšířená o genové a genotypové frekvence třetí alely:
(p + q + r)2 = p2 + 2pq + q2 + 2pr + r2 + 2qr = 1
Relativní genové četnosti Alela
p IA
q IB
r i
Relativní genotypové četnosti Genotyp Fenotyp:
p2 IAIA A
2pq IAIB AB
q2 IBIB B
2pr IAi A
r2 ii
2qr IBi B
6.2 Kvantitativní znaky v populaci
Kvantitativní znaky jsou podmíněny větším počtem genů, než znaky kvalitativní, které jsou výsledkem působení jediného genu (příp. jen několik málo genů). Od kvalitativních znaků se liší ve dvou vlastnostech:
Kvantitativní znaky mají kontinuální proměnlivost. Mezi jednotlivými genotypy neexistují ostré hranice a celkový znak lze zobrazit Gaussovou křivkou (obrázek 5). Typickým příkladem může být tělesná výška člověka. Je nepochybné, že na tento znak má vliv velký počet genů. Proto například můžeme v populaci najít dospělých lidí s tělesnou výškou od cca 140 centimetrů až po více než dvoumetrových jedinců. Jsou to však krajní případy s nízkou četností jedinců, protože nízký tělesný vzrůst může být důsledkem genetické poruchy (např. nanizmus, při kterém chybí somatotropní hormon). Nejvíce jedinců se bude vyskytovat kolem průměrné hodnoty sledovaných kvantitativních parametrů, např. výška mužů se bude pohybovat kolem 180 centimetrů.
Na rozdíl od kvalitativních znaků má na výsledný fenotypový projev sledovaného kvantitativního znaku významný vliv prostředí. Pokud např. dítě zdědilo od rodičů genotyp IAIB, pak bude mít krevní skupinu AB bez ohledu na to, zda bude žít v bídném slumu velkoměsta rozvojové země nebo v rodinném sídle na venkově vyspělého evropského státu. V případě kvantitativního znaku, jakým je výška jedince, už to jedno nebude, protože výživa v dětství má významný vliv na celkovou tělesnou konstituci člověka.
Důležitá poznámka: Při posuzování toho, zda je sledován znak kvalitativní nebo kvantitativní, vycházíme od účelu testování. Krevně skupinový systém AB0 jsme vybrali jako příklad takového přístupu. Pokud určujeme krevní skupinu konkrétního jedince, jde bezpochyby o kvalitativní znak. Pokud ovšem budeme experimentální stanovovat množství antigenů A nebo B na povrchu cytoplazmatické membrány erytrocytů, přijdeme překvapivě k poznání, že jejich hustota na danou plochu je u různých jedinců jiná. Z tohoto úhlu pohledu by se tedy mohlo jednat také o kvantitativní znak. Z hlediska laboratorního stanovení krevních skupin je však požadavek na takové stanovení v medicínské praxi bezpředmětný.
Na rozhraní kvalitativních i kvantitativních znaků jsou znaky semikvantitativní, které můžeme posuzovat z obou uvedených kategorií. Příkladem může být schopnost rozeznat hořkou chuť fenylthiokarbamidu (PTC). Ve své molekule obsahuje skupinu (=N)2-C=S, která je přítomna i v mnoha léčivech a přírodních látkách. Při testování dobrovolníků na rozeznání chutě PTC v sérii vzorků se stoupající koncentrací lze jedinců rozdělit na senzitivních vůči hořké chuti PTC a na ty, kteří ji nerozeznají, příp. ho rozeznají pouze ve vzorcích s nejvyšší koncentrací (obrázek 5). Na druhé straně je u jedinců v obou kategoriích přítomna kontinuální proměnlivost v schopnosti rozeznání PCT při určité koncentraci, což můžeme považovat za kontinuální proměnlivost.
Obrázek 5 - Příklady distribuce kvalitativních a kvantitativních znaků v populaci
Poznámka: Příklad PTC jsme nevybrali náhodně. Vzhledem k hořké chuti některých přírodních látek i farmak může představovat míra rozeznání této chutě v závislosti od koncentrace látky u pacientů důležitý faktor při terapii.
Rozdíly ve fenotypu (P) mezi kterýmikoli jedinci v sledovaném znaku lze vyjádřit jako výsledek spolupůsobení genetické složky (G) a vnějšího prostředí (E) podle vztahu:
P = G + E (6)
Část variability sledovaného znaku, která je podmíněna geneticky, vyjadřuje tzv. dědivost (heritabilita) h2 podle vztahu:
h2 = σ2G/ σ2P (7)
P = G + E (6)
Část variability sledovaného znaku, která je podmíněna geneticky, vyjadřuje tzv. dědivost (heritabilita) h2 podle vztahu:
h2 = σ2G/ σ2P (7)
σ2G – genotypová variabilita
σ2P - celková fenotypová variabilita
Hodnota heritability vyjádřena tímto způsobem se nazývá heritabilita v širším slova smyslu. Je součtem všech forem genetické determinace kvantitativních znaků jedince, na kterých participuje více genů. Patří sem dominance a recesivita, kodominance, superdominance a neúplná dominance, aditivita a různé formy genových interakcí. Ne všechny uvedené složky genetické variability jsme schopni exaktně postihnout a předvídat jejich kombinaci v následující generaci. Pokud např. sledován znak podmiňují geny, mezi kterými je vztah dominance a recesivity a navíc mají některé z nich např. pleiotropní efekt, je velmi obtížné stanovit pro jejich přínos matematický vztah. Výjimkou je tzv. aditivita. Pod aditivním účinkem alel genů, které podmiňují sledován znak, rozumíme sumační efekt - sčítání jejich vlivu. Uvažujme například o hypotetickém kvantitativním znaku, který je podmíněn třemi geny (A, B, C), z nichž každý má dvě alely. Jedna je funkční, která přispívá k projevu znaku (alely A, B a C), druhá ke znaku nepřispívá (a, b, c). (Poznámka: při tomto typu dědičnosti se neaktivní alela nezvykne nazývat "recesivní", jak je tomu u mendelistické dědičnosti). Platí aditivita, tedy pravidlo, že znak bude u jedince tím výraznější, čím větší počet aktivních alel bude jeho genotyp obsahovat. Pokud máme např. rodičovské jedince, kteří mají stejnou míru projevu znaku, podmíněnou ovšem různými alelami, jejich potomstvo může mít projev znaku dokonce výraznější právě díky "sčítání" vlivů aktivních alel obou rodičů:
P: AabbCc x aaBBcc 2 aktivní alely
F1: aaBbcc 1 aktivní alela (znak je méně výrazný, než u rodičů)
aaBbCc 2 aktivní alely (shoda s projevem znaku u rodičů)
AaBbcc 2 aktivní alely (shoda s projevem znaku u rodičů)
AaBbCc 3 aktivní alely (výraznější projev znaku ve srovnání s rodiči)
Proto představuje aditivita důležitou složku genetické proměnlivosti, která se používá k vyjádření tzv. heritability v užším slova smyslu:
h2 = σ2A/ σ2P (8)
σ2A – aditivní složka genotypové variability
σ2P - celková fenotypová variabilita
7 Aplikace genetiky ve zdravotnictví
Název kapitoly nám signalizuje, že tato část studijní opory bude věnována praktickým aplikacím genetiky ve zdravotnictví. Od této kapitoly dále využijeme teoretické zákonitosti genetiky, získané v kapitolách 2-6, pro pochopení a diagnostiku genetických patologických stavů u člověka.
7.1 Genealogické vyšetření
Genealogická analýza slouží k sestavení rodokmenu konkrétní rodiny. Jeho cílem je určit způsob dědičnosti sledovaného znaku v rodině a stanovit riziko jeho výskytu v dalších generacích. Na sestavení rodokmenu se používají mezinárodně používané symboly, které jsou uvedeny na obrázku 6. Sestavování začíná od jedince, kterého nazýváme proband. V rodokmenu se označuje šipkou (obrázek 6). Nejčastěji jde o postiženého jedince nebo o jedince, který vyžaduje konzultace např. ohledně míry rizika přenosu geneticky podmíněné poruchy na své potomstvo.
Poznámka: V používání symboliky existují ve světě drobné rozdíly, ty však nejsou natolik závažné, aby bránily pochopit znázorněný rodokmen, proto se jim blíže nebudeme věnovat.
Cílem této kapitoly je vysvětlit povahu dědění jednotlivých znaků. Proto si vytvoříme hypotetický rodokmen (obrázek 6). Na tomto rodokmenu si ukážeme typický projev autozomálních dominantních alel, autozomálních recesivních alel, dominantních alel vázaných v nehomologním úseku chromosomu X, recesivních alel vázaných v nehomologním úseku chromosomu X a matroklinní dědičnosti, kterou musíme brát v úvahu v případě mitochondriálních genů.
Poznámka: Je jasné, že v jediném rodokmenu se nemohou vyskytovat všechny uvedené typy, které jsou vyznačeny na obrázku 6. Jsme však toho názoru, že jediná hypotetická schéma rodokmenu může napomoci rychlejšímu pochopení podstaty jednotlivých typů dědičnosti bez nutnosti nanovo pochopit příbuzenské vztahy, která by byla nutná v případě odlišných rodokmenů.
Jednotlivé generace se v rodokmenu označují římskými čísly. Jedinci se v rámci téže generace označují arabskými čísly podle pořadí narození. Např. v hypotetickém rodokmenu (obrázek 6A) první generaci tvoří manželský pár I1 a I2. Měli šest vlastních biologických dětí (II2, II4, II6, II8, II10 a II13) a jednoho adoptivního syna (II12). Jejich vnuk (III3) pochází z prvního manželství nejstaršího syna (II2). Po rozvodu se nejstarší syn podruhé oženil a měl tři děti, prvního syna (III3) a dvě dcery (III4 a III5). Kluk III1 je polorodý sourozenec dětí III3, III4 a III5 (stejný otec, různé matky). V rodině je příbuzenský sňatek mezi bratrancem a sestřenicí prvního stupně (III11 a III12), přičemž otec muže (II8) je starším bratrem matky jeho manželky, která je současně jeho sestřenicí (II13). Uvedený příbuzenský pár měl dva neúspěšné pokusy o dítě, které skončily spontánním abortem (IV1, IV2). Následně si pár adoptoval děvčátko (IV3). Po využití technik asistované reprodukce se jim narodily dvě děti, starší holčička (IV4) a nejmladší chlapeček (IV5).
Obrázek 6 - Jednotlivé typy dědičnosti
Autozomálně recesivní vlohy mají tyto specifika (obrázek 6C):
Po přehledem vysvětlení povahy jednotlivých typů dědičnosti při sledování rodokmenu si musíme objasnit důsledky příbuzenského křížení. Pokud se vrátíme k vysvětlení autozomálně recesivního typu dědičnosti, víme, že převážná část mutantních alel je v heterozygotním stavu a proto se jimi podmíněné onemocnění neprojevuje. Porucha vzniká pouze v případě, pokud se u jedince setkají dvě mutantní alely od obou heterozygotních rodičů. Obě recesivní alely v tomto případě mohou, ale také nemusí být identické původem (IBD). Např. v případě fenylketonurie (kapitola 5.1 Klasifikace mutace) známe několik různých mutantních alel. Je to logické, protože mutace může zasáhnout různá místa příslušného genu, přičemž výsledek je stejný - znefunkčnění enzymu fenylalaninhydroxylázy.
Poznámka: Při výpočtu inbredního koeficientu probanda se za nulovou generaci pokládá generace jeho rodičů, jako první je generace jeho prarodičů, druhá bude generace praprarodičů, atd. Pro uvedený příklad červeně označeného probanda na obrázku 7 činí inbrední koeficient Fx = ∑ [ (1/2) 2 + 2 +1 . (1 + 0)] = 0,03125. Výsledek platí ovšem pouze za předpokladu, že hodnota inbredního koeficientu společného předka FA=0 (tj. nepochází z příbuzenského svazku).
Pro autozomálně dominantní alely jsou specifické následující vlastnosti (viz obrázek 6B):
- postižení jedinci mají postiženého jednoho ze svých rodičů, přičemž nezáleží na pohlaví rodiče,
- postižení jedinci se vyskytují v každé generaci sledovaného rodokmenu,
- vzhledem k frekvenci patologických alel se ve většině případů nemocných jedinců jedná o heterozygoty, kteří mají jednu alelu patologickou a druhou normální,
- postižení jedinci mají ve svém potomstvu zdravé i postižené jedince v poměru 1:1, bez ohledu na pohlaví. Vyplývá to z jejich genotypu, který obsahuje dominantní (patologickou) alelu spolu s recesivní (normální) alelou,
- zdraví jedinci, kteří jsou potomky postižených jedinců, patologický znak do svého potomstva nepřenášejí.
Příkladem postižení tohoto typu je hereditární eliptocytóza, při níž od několika měsíců po narození jedince začínají v krvi kolovat erytrocyty eliptického tvaru. Těchto krvinek je časem většina. Normální erytrocyty se v kapilárách deformují, jsou však schopny nabýt původní tvar. V případě eliptocytózy však buňky po deformaci v kapilárách již nejsou schopny dosáhnout původní tvar. U pacientů je tento stav často spojený s hemolytickou anémií.
Dalším příkladem je segmentární neurofibromatóza, nazývaná také jako Recklinghausenova nemoc. Je důsledkem mutací genu pro neurofibromin, který se nachází na chromosomu č. 17, pozice 17q11.2. Hlavními příznaky jsou neurofibromy (nezhoubné nádory periferních nervů) a typické světlé skvrny na pokožce.
Autozomálně recesivní vlohy mají tyto specifika (obrázek 6C):
- rodiče postižených jedinců nevykazují známky onemocnění,
- oba rodiče postižených jedinců jsou přenašeči (heterozygoti) pro recesivní alelu,
- obě pohlaví bývají postižena ve stejné míře,
- pro dvojici heterozygotních rodičů je pravděpodobnost narození dítěte s postižením rovná ¼,
- vzhledem ke své nízké frekvenci se patologické alely v populaci nachází převážně v heterozygotním stavu u jedinců bez příznaků onemocnění.
- projev téhož onemocnění u sledovaného probanda může být podmíněn odlišnými recesivními mutacemi (to je i případ fenylketonurie), které vznikají v různých částech genu. Mluvíme o allozygotním genotypu.
- postižený jedinec může ovšem také mít pro sledovaný znak přítomny dvě stejné mutantní alely (IBD, angl. identical by descent), které vznikly u společného předka mateřské nebo otcovské linie rodokmenu. Mluvíme o autozygotním genotypu (viz dále obrázek 7).
- pokud má postižený jedinec obě mutantní alely IBD, bývá to důsledek příbuzenského křížení.
Příkladem poruchy podmíněné autozomálně recesívními mutacemi může být fenylketonurie (viz kapitola 5.1 Klasifikace mutací, příklad 1). Dědičnost fenylketonurie se v rodokmenech projevuje tak, jak je tomu v případě jedinců na obrázku 6 C: Rodiče (II10 a II11) jsou zdraví heterozygoti, od kterých zdědí obě Mutantní alely jejich nejmladší syn (III15).
V případech některých jiných onemocnění je však v populaci vyšší pravděpodobnost sňatku postižených jedinců, kteří jsou recesivními homozygoty pro danou chorobu. Paradoxní příčinou tohoto jevu je jejich sociální segregace (např. specializované školy pro takto postižené děti apod.). Příkladem je autozomálně recesivně podmíněna hluchoněmota. Tento jev je uveden na obrázku 6C vlevo. Oba postižení jedinci (II2 a II3) uzavírají sňatek v důsledku sociální segregace. V tomto případě všechny jejich děti mohou být postiženy.
X-vázaná dominantní dědičnost je znázorněna na obrázku 6D. Všimněme si proto na uvedeném modelovém rodokmenu povahy dědičnosti takového znaku:
- Tímto způsobem se dědí znaky, podmíněné dominantními alelami genů, které jsou lokalizovány v nehomologním úseku chromosomu X,
- podíl postižených žen v populaci je přibližně dvojnásobkem počtu postižených mužů. Je tomu tak proto, že u žen je projev znaku podmíněn přítomností dvou alel genu, zatímco u mužů se pro sledovaný gen nachází pouze jediná alela (hemizygotní stav, viz kapitola 4.5 Genetická informace a pohlaví),
- postižený muž má postižené pouze dcery, synové nejsou postižení (chromosom X dědí od matky),
- znak se projeví u každého jedince, který sledovanou dominantní alelu nese. Na příkladu, uvedeném na obrázku 6D lze vidět, že od otce (II14) zdědily dominantní vlohu všechny dcery (III12, III16, III17, III19), protože od otce dostaly jeho jediný chromozom s dominantní alelou sledovaného genu. Od matky III12 zdědil dominantní alelu její syn (probandi IV5), jeho starší sestra IV4 však od obou rodičů zdědila obě standardní alely.
Příkladem X-vázané dominantní dědičnosti může být hypofosfatémie. V důsledku poruchy resorpce anorganického fosfátu v renálních tubulech dochází k jeho zvýšenému vylučování močí z těla. V důsledku toho dochází k poklesu koncentrace fosfátu v séru postižených jedinců. Následkem bývá rachitida, deformace kostí v důsledku jejich oslabení osteomalacií. Mluvíme o vitamin D rezistentní rachitidě, protože postižení pacienti reagují pouze na vysoké dávky tohoto vitamínu.
X-vázaná recesivní dědičnost je znázorněna na obrázku 6E. Jde o znaky, které jsou podmíněny recesivními alelami genů, lokalizovanými na nehomologním úseku chromosomu X. O teoretických aspektech tohoto typu dědičnosti pojednává kapitola 4.5. Zde si charakterizujeme chování této dědičnosti v rodokmenu:
- Recesivní alela se projeví buď pouze v homozygotním stavu u ženy, nebo v hemizygotním stavu u muže,
- z hlediska poměru pohlaví postižených onemocněním je počet postižených mužů mnohem vyšší,
- postižený muž (na obrázku 6E jde o muže II14) bude mít v případě sňatku se zdravou ženou (II13) všechny své syny zdravé (synové III18 a III20; chromosom X dědí totiž od matky). Všechny jeho dcery budou zdravé, ale přenašečky (III12, III16, III17 a III19)
- Heterozygotní žena (přenašečka) bude mít v případě sňatku se zdravým mužem 50% pravděpodobnost, že syn bude postižen onemocněním (na obrázku 6E případ ženy III12, která je přenašečka a od které zdědí chromosom X s mutantní alelou její syn IV5).
Příkladem X-vázané recesivní dědičnosti je hemofilie. Na nehomologních úseku chromozomu X je lokalizován gen pro koagulační faktor VIII (antihemofilický faktor A). Jeho mutací může dojít ke vzniku hemofilie A. Na nehomologním úseku chromosomu X se nachází i gen pro koagulační faktor IX (Christmas faktor, antihemofilický faktor B). Jeho mutační změnou dochází ke vzniku hemofilie B. Frekvence výskytu hemofilie A u mužů je udávána přibližně 1/20000.
Poznámka: U žen je výskyt hemofilie mnohem nižší. Je to podmíněno statisticky. Zmíněná frekvence výskytu znamená, že u jednoho muže z dvaceti tisíců se vyskytne chromosom Xh s mutantní alelou. Víme, že poměr pohlaví je u lidí v produktivním věku v podstatě 1:1. Dále také víme, že dvě třetiny chromosomů X v populaci jsou v genomu žen (mají genotyp 46 XX) a jedna třetina chromosomů X u mužů (mají hemizygotný genotyp 46 XY). Z toho logicky vyplývá, že přenašečkou je statisticky jedna žena z deseti tisíc (1/10000). Proto celková pravděpodobnost narození ženy postižené hemofilií (XhXh) je dána součinem pravděpodobností výskytu alely Xh u muže (1/20000), u ženy-přenašečky (1/10000) a pravděpodobnosti přenosu alely Xh z přenašečky na potomstvo, která činí 1/2:
1/20000 · 1/10000 · 1/2 = 1/400000
Dědičnost znaků podmíněných geny na mitochondriální DNA je specifická tím, že se děje výhradně po mateřské linii (viz kapitola 2.1 Chromosomy). Tento typ dědičnosti je znázorněn na obrázku 6F. Matka (I2) odevzdá sledovaný gen všem potomkům bez rozdílu pohlaví (II2, II4, II6, II8, II10 a II13). Výjimkou je adoptovaný syn II12, který pochopitelně sledován znak od adoptivní matky nemá. Synové této matky na své potomstvo znak nepřenášejí (např. II2, II8). Dcery matky (II6, II10 a II13) opět tento znak odevzdají všem svým dětem.
Příkladem matrokliní dědičnosti je Leberova optická neuropatie. Projevuje se atrofií optických nervů, jež nastává mezi 12-30 rokem života.
Po přehledem vysvětlení povahy jednotlivých typů dědičnosti při sledování rodokmenu si musíme objasnit důsledky příbuzenského křížení. Pokud se vrátíme k vysvětlení autozomálně recesivního typu dědičnosti, víme, že převážná část mutantních alel je v heterozygotním stavu a proto se jimi podmíněné onemocnění neprojevuje. Porucha vzniká pouze v případě, pokud se u jedince setkají dvě mutantní alely od obou heterozygotních rodičů. Obě recesivní alely v tomto případě mohou, ale také nemusí být identické původem (IBD). Např. v případě fenylketonurie (kapitola 5.1 Klasifikace mutace) známe několik různých mutantních alel. Je to logické, protože mutace může zasáhnout různá místa příslušného genu, přičemž výsledek je stejný - znefunkčnění enzymu fenylalaninhydroxylázy.
Důležitá poznámka: Část recesivních alel vzniká u jedinců de novo mutacemi, proto při genetickém vyšetření rodičů postiženého jedince, který nese obě mutantní alely, může nastat situace, že jeden z rodičů není heterozygotní pro mutantní alelu, přesto je biologickým rodičem postiženého dítěte.
V případě příbuzenského křížení však může nastat situace, že se u postiženého jedince setkají recesivní alely, které jsou idenitcké původem (alela společná původem - z angl. identical by descent, IBD alela; obrázek 7, červená barva). Na uvedeném modelovém příkladu vidíme, že u předka postiženého jedince (zdravé prababičky I2) mohlo dojít ke vzniku recesivní mutace. Ta se následně přenesla do homozygotního stavu postiženého jedince (červený proband IV5) díky příbuzenskému křížení (zdraví rodiče červeně označeného probanda jsou svazkem bratrance a sestřenice, přičemž jsou vnuci zdravé ženy, u které mutace vznikla). Vidíme, že příbuzenské křížení zvyšuje riziko projevu recesivních alel, které jsou v populaci. V protikladu s tím se v panmiktické populaci, ve které je minimální podíl příbuzenského křížení, na vzniku postižených jedinců mohou podílet mutantní alely různého původu (modrá a červená barva u postiženého jedince III1, u kterého každý z jeho rodičů II1 a II2 má různou mutantní alelu).
Obrázek 7 - Příbuzenské křížení
Příbuzenské křížení se nazývá také jako inbríding (z angl. inbreeding). Oba jedinci v případě příbuzenského křížení však nemusí mít pouze jediného společného předka, ale může jich být v rodokmenu víc. Příbuzenské křížení se dnes vyskytuje v malých izolovaných populacích (např. málo osídlené odlehlé ostrovy), respektive pod vlivem socio-religiózních vlivů (příbuzenské sňatky mezi bratrancem a sestřenicí jsou poměrně časté v muslimských zemích vzhledem ke specifikám jejich kultury a tradic). Dalším důvodem inbrídingu je zvyk hledat si partnera ze stejné usedlosti z důvodu snahy o nedělení majetku komunity nebo z důvodu sociální segregace (ghetta). Důsledkem tohoto chování populace může být vznik tzv. genetických izolátů, ve kterých je nezvykle vysoký stupeň příbuznosti mezi jedinci.
Pravděpodobnost, s jakou potomek příbuzenského vztahu nese pro sledovaný gen dvě mutantní alely identické původem, nám udává inbrední koeficient. Zavedl ho r. 1922 Sewell Wright a je dán vztahem:
Fx inbrední koeficient
m počet generací mezi probandem a společným předkem v mateřské linii
n počet generací mezi probandem a společným předkem v otcovské linii
FA inbrední koeficient společného předka
Uvedený vzorec vychází ze stupně konsangvinity (stupně příbuznosti) mezi jednotlivými členy rodokmenu, daného koeficientem příbuznosti r:
r koeficient příbuznosti
n počet generací v rodokmenu
Stupeň příbuznosti mezi rodičem a potomkem činí r=(1/2)1 (čili 0,5), mezi prarodičem a potomkem představuje r=(1/2)2 = 1/4 (čili 0,25). Příbuznost mezi potomkem a praprarodičem je ještě nižší a činí r = (1/2)3 = 1/8 (čili 0,125).
Poznámka: Při výpočtu inbredního koeficientu probanda se za nulovou generaci pokládá generace jeho rodičů, jako první je generace jeho prarodičů, druhá bude generace praprarodičů, atd. Pro uvedený příklad červeně označeného probanda na obrázku 7 činí inbrední koeficient Fx = ∑ [ (1/2) 2 + 2 +1 . (1 + 0)] = 0,03125. Výsledek platí ovšem pouze za předpokladu, že hodnota inbredního koeficientu společného předka FA=0 (tj. nepochází z příbuzenského svazku).
Z hlediska humánní genetiky představuje příbuzenské křížení problém. V populaci způsobuje nárůst početnosti škodlivých, většinou recesivních alel. Eliminace důsledků tohoto jevu může trvat dlouhé období. Velmi důležitá je kromě léčebně preventivní péče i osvěta zdravotnických pracovníků v postižených komunitách.
7.2 Cytologická analýza
Cytologická analýza se využívá v cytogenetice. S pomocí optického (a někdy i fluorescenčního) mikroskopu se hodnotí počet chromosomů, jejich struktura a anomálie (obrázek 8).Chromosomy jsou pod světelným mikroskopem pozorovatelné pouze ve spiralizovaném stavu, ve kterém se nacházejí během buněčného dělení – mitózy (viz kapitola 4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk).Nejčastějšími vzorky pro cytogenetickou analýzu pacientů jsou leukocyty v periferní krvi a plodová voda (při prenatální diagnostice), avšak lze zpracovat i jiné typy tkání (tumory apod.). Buňky ze získané vzorky se pomnoží kultivací a zastaví se v první části buněčného dělení - metafázi. Dosáhne se to s použitím tzv. mitotických jedů (např. kolchicin), které blokují funkci dělícího aparátu buňky, takže chromosomy zůstávají spiralizovány v její ekvatoriální rovině.Působením kombinací různých barviv a enzymů dochází k narušení povrchu spiralizovaných chromosomů a ke vzniku obrazců (proužků, angl. bands). Počet a uspořádání těchto proužků je pro jednotlivé chromosomy charakteristické a pomáhá diagnostikovat anomálie a poškození chromosomů.
Základním zpracováním chromosomů je G-proužkování (využívá aplikaci trypsinu a Giemsova barviva. Kromě toho známe R-proužkování, při kterém je obrazec vzniklých proužků reverzní (jakoby fotografický negativ) vůči G-proužkování. Při C-proužkování jsou velmi dobře pozorovatelné centromery chromozomů. Q-proužkování využívá chiakridin a při NOR-proužkování se chromosomy vizualizují s pomocí AgNO3.
Techniky proužkovaný chromozomů HRT (z angl. high resolution techniques) využívají zastavení dělení buněk před metafází (tzv. prometafáze, na rozhraní profáze a metafáze). Proto jsou chromosomy méně spiralizované, jsou delší, jemnější a lze pozorovat více pruhů (cca 800).
Obrázek 8 - Princip cytologické analýzy
Na obrázku 8 můžeme vidět karyotyp normální ženy. Počet, tvar a velikost chromosomů jsou pro každý druh konstantní. V tabulkách 5 a 6 je uvedeno třídění lidských chromosomů.
Tabulka 5 Rozdělení lidských chromosomů
Charakteristika
|
Skupina chromosomů | ||||||
A |
B |
C |
D |
E |
F |
G | |
Autozomy |
1 - 3 |
4 – 5 |
6 – 12 |
13 – 15 |
16 – 18 |
19 – 20 |
21- 22 |
Gonozomy |
- |
- |
X |
- |
- |
- |
Y |
Počet u muže |
6 |
4 |
15 |
6 |
6 |
4 |
5 |
Počet u ženy |
6 |
4 |
16 |
6 |
6 |
4 |
4 |
Tabulka 6 Charakteristika chromosomů podle velikosti a polohy centromery
Skupina chromosomů |
Charakteristika |
A |
Velké metacentrické chromosomy (centromery víceméně uprostřed chromosomu, obě raménka chromosomu stejně dlouhé) |
B |
Velké submetacentrické chromosomy (centromery posunuta mimo střed chromosomu, vznik kratšího raménka „p“ a delšího raménka „q“) |
C |
Středně velké metacentrické chromosomy |
D |
Středně velké akrocentrické chromosomy (centromery poblíž konců chromosomů-telomer)
|
E |
Malé submetacentrické chromosomy |
F |
Malé metacentrické chromosomy |
G |
Malé akrocentrické chromosomy |
Uvedenými technikami je možné ověřit přítomnost chromosomálních i genomových mutací, o kterých bylo pojednáno v kapitole 5.1 Klasifikace mutací.
7.3 Biochemická genetika
Na počátku 20 století si britský lékař Archibald Garrod všiml společné symptomatologie u pacientů, kteří trpěli alkaptonurií. Tuto poruchu způsobují mutace genu pro enzym homogentizát 1,2-dioxygenáza (HGD). Pokud se v játrech tento enzym následkem mutací inaktivuje, v organismu se hromadí jeden z metabolitů aminokyseliny tyrosinu - kyselina homogentisová. Vylučuje se močí, která proto ztmavne při stání. Polymer kyseliny homogentisové se jako pigment ukládá v chrupavkách a pojivových tkáních, které tím získávají typickou pigmentaci (ochronózu). Také způsobuje artritidu, přičemž nejvíce bývají postiženy velké klouby a páteř.
Garrod si jako první všiml, že uvedený soubor symptomů je přenášen v rodokmenu postižených probandů. Jinými slovy, jedná se o genetickou vlohu. Vzhledem k tomu, že Mendelovy zákony byly v té době právě "znovuobjeveny" a širší odborné veřejnosti stále v podstatě neznámé, podobně jako biochemická podstata metabolických dějů člověka, také Garrodův objev zůstal na několik desetiletí nedoceněný.
Dnes víme, že alkaptonurie je autozomálně recesivní dědičné onemocnění, jehož podstatou je ztráta aktivity enzymu homogentizát 1,2 dioxygenázy. Její gen se nachází u člověka na delším raménku chromozomu č. 3, lokace 3q21-23. Defektní enzym mohou způsobit mutace na více místech nukleotidové sekvence genu. Dnes jich je známých několik desítek. Většina mutantních (recesivních) alel je skryta u heterozygotů, kteří jsou metabolicky zdraví, protože na druhém chromozomu mají standardní "zdravou" alelu. Pokud se u jedince setkají dvě mutantní alely (které nemusí být identické), jedinec je postižený alkaptonurií. V naší populaci je frekvence tohoto onemocnění přibližně 1: 20000 novorozenců.
Příklad alkaptonurie jsme neuvedli náhodou a chceme jím zdůraznit provázanost biochemických metabolických drah člověka. Tato dědičná choroba je důsledkem selhání jednoho z enzymů téže dráhy, kde v jednom z kroků vzniká mutací i fenylketonurie, kterou jsme se podrobně zabývali v kapitole 5.1 Klasifikace mutací (Příklad 1).
Na obrázku 9 můžeme vidět souvislost metabolické dráhy s genetickou konstitucí pro enzymy, které organismus využívá v jednotlivých krocích biochemické dráhy. Na základě příkladu na obrázku 9 můžeme vyvodit následující důležité závěry:
- biochemické pochody v organismu jsou katalyzovány enzymy, jejichž struktura i funkce je dána geneticky,
- metabolismus se skládá z jednotlivých biochemických drah, které jsou vzájemně propojeny,
- mutace poškozuje v metabolické dráze sice pouze jeden krok, může tím však ovlivnit celý další sled biochemických reakcí.
Pokud již jednou vznikla mutace, její výsledný efekt na produkt postiženého genu závisí od toho, na jakém místě tento gen poškodila. Obecně rozeznáváme poruchy struktury enzymu, které způsobí jeho výslednou dysfunkci a poruchy v regulaci kvantitativní produkce enzymu, které ovlivňují jeho výslednou celkovou aktivitu v organismu.
V této souvislosti zdůrazňujeme pojem genetický polymorfismus, který chápeme jako společný výskyt dvou a více alel sledovaného genu v populaci v takové četnosti, že není pravděpodobné, aby byly výsledkem náhodných mutací. Většinou se jako populační hranice početnosti pro tento typ alel považuje 1 %. Z toho vyplývá, že polymorfismem jsou nám již dobře známé krevní skupiny z kapitoly 4.3. Nejsou však zdaleka jediné. Značná část enzymového arzenálu organismu vykazuje heterogenitu tohoto typu.
Obrázek 9 - Spřažení biochemických reakcí v metabolické dráze
Legenda: enzym fenylalanin monooxigenáza je podmíněná genem, který je lokalizován na delším raménku chromosomu č. 12. Enzym tyrozináza kóduje gen, který se nachází na delším raménku chromosomu č. 11. Poblíž konce delšího raménka chromosomu č. 12 se nachází gen, kódující enzym 4- hydroxyfenylpyruvát dioxigenázu. Struktura a funkce enzymu homogentizát 1,2-dioxigenázy je podmíněná genem, který je lokalizován na delším raménku chromosomu č. 3. Vidíme, že jediná metabolická dráha je podmíněna geny, které jsou umístěny na různých chromozomech.
Výše uvedený učebnicový příklad alkaptonurie a následné vysvětlení genetického polymorfismu má velmi důležitý dopad na využití poznatků ve farmakogenetice. Farmakogenetika v moderním pojetí sleduje genetický individualismus organismu vzhledem na jeho schopnost metabolizace léčebných přípravků. Jako příklad jsme nastínili různou schopnost jedinců rozeznávat hořkou chuť PTC (kapitola 6.2; obrázek 5). Podobná variabilita platí i pro jiné farmaceutické produkty. Je známá např. senzitivita na antimalarikum primaquin v důsledku deficitu aktivity glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, nebo vznik periferní neuropatie při podání isoniazidu v důsledku zpomalené metabolizace (acetylace) tohoto antituberkulotika.
7.4 Molekulárně genetické metody
V současnosti jsou v medicíně používány stovky laboratorních molekulárně-genetických analýz a jejich počet a metodologická různorodost neustále vzrůstají. Bližší popis těchto metodik přesahuje rámec a určení této studijní opory. Můžeme však konstatovat, že téměř všechny jsou založeny na dvou základních vlastnostech DNA a nukleových kyselin obecně:
- Nukleové kyseliny jsou na rozdíl od bílkovin schopné renaturace po působení vysokých teplot. Pokud DNA vystavíme teplotě nad 72°C, oba antiparalelní řetězce se oddělí v důsledku roztržení slabých vodíkových vazeb mezi bázemi A-T a G-C. Mluvíme o denaturaci DNA. Ostatní chemické vazby však zůstávají v obou oddělených řetězcích nedotčené. Proto při snížení teploty dochází opět k párování bází obou řetězců podle vzájemné komplementarity a vzniku dvouřetězcové DNA. Mluvíme o renaturaci DNA.
- Během renaturace DNA se rychleji dokáží párovat kratší řetězce DNA. Čím je řetězec delší, tím déle bude renaturace probíhat.
Uvedené principy využívá i polymerázová řetězová reakce (PCR). Používá se k namnožení (cizím slovem k amplifikaci) a následnému vyšetření specifického úseku DNA, který potřebujeme vyšetřit. Obvykle se tím ověřuje přítomnost rizikové alely u pacienta, nebo přítomnost patogenu (např. viru hepatitidy B) s pomocí stanovení jeho RNA. PCR je založena na stejných principech, jako replikace DNA (kapitola 3.1). Rozdíl je v tom, že se děje ve zkumavce a ne v organismu, přičemž se využívá enzym polymeráza, který je stabilní při vyšších teplotách a nedochází k jeho denaturaci teplem. Pochází z bakterií, které žijí v horkých pramenech, nazývaných Thermophilus aquaticus. Podle toho se tento enzym označuje jako Taq-polymeráza.
Princip PCR je uveden na obrázku 10. Reakce se skládá ze tří kroků, které se cyklicky opakují:
- Při denaturaci se působením teploty okolo 95 °C oddělí oba původní řetězce DNA pacienta s genem, který chceme vyšetřit.
- Při ochlazení na teplotu kolem 55 °C až 68 °C dochází k opětovnému párování řetězců. V zkumavce jsou přidány tzv. primery. Jsou to krátké jednořetězcová DNA s délkou do 30 bází, které jsou komplementární s oběma konci úseku DNA, který chceme vyšetřit. Spárují se spíše jako původní dlouhé řetězce. Od nich začíná Taq-polymeráza replikaci, tedy syntézu nového DNA - řetězce.
- Syntéza nového řetězce pokračuje při teplotě 72 °C. Po tomto kroku vidíme, že z původní jedné molekuly DNA vznikly dvě. Princip je tedy přesně tentýž, jako byl popsán v kapitole 3.1 replikace, avšak reakce neprobíhá in vivo v jádru buňky pacienta, ale in vitro ve zkumavce v laboratorním přístroji.
Obrázek 10 - Princip polymerázové řetězové reakce
Po několikanásobném cyklickém zopakování těchto tří kroků dostaneme dostatečné množství požadovaného úseku DNA, abychom mohli provést jeho stanovení. Matematicky dostaneme 2n kopií původní dvouřetězcové DNA, kde n je počet cyklů.
Po klasické PCR reakci obvykle následuje zpracování úseku DNA. K tomuto účelu lze použít tzv. restrikční endonukleázy. Jsou to enzymy, které rozpoznávají specifické sekvence nukleotidů v DNA. V těchto místech štěpí enzymy dvoušroubovici DNA. U mnoha testovaných genů v případě vzniku mutantních alel takové místo opravdu vzniká, nebo se mutací ztrácí. Proto je možné aplikovat příslušnou restrikční endonukleázu (RE) na vzorek DNA. Působením RE dojde k rozštěpení původní DNA na několik kratších molekul. Ty lze podle jejich délky oddělit s pomocí elektroforézy působením stejnosměrného elektrického proudu. Kratší řetězce DNA se během elektroforézy pohybují rychleji, delší (a proto těžší) řetězce se pohybují pomaleji. Po ukončení elektroforézy a vizualizaci gelu je možné vidět výsledek analýzy a určit genotyp pacienta (obr. 11).
Příklad 1: Gen FV se nachází na chromozomu 1, lokaci 1q23. Kóduje protein zvaný koagulační faktor V, hrající důležitou roli v hemostáze a formování krevní sraženiny. Protein je produkován především v játrech. V krvi cirkuluje inaktivní, po poškození cévní stěny se aktivuje faktorem Xa (na aktivní faktor Va) přičemž dochází ke konverzi protrombinu na aktivní formu-trombin. Ten spouští tvorbu fibrinových vláken. Aktivovaný protein C (APC) snižuje tvorbu fibrinu štěpením faktoru Va, díky němuž je Va inaktivní. Leidenská mutace v místě nukleotidové sekvence 1691mění guanin za adenin. Tím se v průběhu translace mění aminokyselina arginin v pozici 506 molekuly faktoru V za glutamin. Tato záměna modifikuje místo štěpení pro APC a enzym se stává APC-rezistentním. Následkem toho proces koagulace probíhá déle než je potřeba a zvyšuje se riziko tvorby abnormálních krevních sraženin. Výsledky molekulárně-genetické analýzy vzorek pacientu znázorňuje obr. 11.
Obrázek 11 - Vyšetření přítomnosti Leidenské mutace koagulačního faktoru V.
Velmi důležité je i zjištění pořadí nukleotidů v určitém úseku DNA u pacienta. Proto se provádí tzv. sekvencováni DNA. Je založeno na využití modifikovaných stavebních složek nukleových kyselin. Část zásoby v průběhu syntézy DNA (pomocí PCR) netvoří klasické deoxyribonukleotidy (obr. 1) ale tzv. dideoxyribonukleotidy, které na 3 '-OH skupině deoxyribózy mají pouze vodík. Díky tomu se syntéza nového řetězce na takto změněném stavebním prvku zastaví. Výsledkem je směs řetězců DNA s různou velikostí, které končí na pozměněné dideoxyribonukleotidové variantě. Všechny čtyři modifikované varianty (dideoxyadenozin, dideoxyguanozin, dideoxytymidin a dideoxycytozin) jsou značeny různými fluorescenčními barvami. Proto během elektroforézy směsi řetězců DNA můžeme na základě optického signálu stanovit pořadí nukleotidů ve vyšetřovaném úseku DNA. Stanovení sekvence DNA je důležité zejména v onkologii. Příkladem muže být stanovení alel genů BRCA1 (chromozom č. 17; lokace 17q21) a BRCA2 (chromozom č. 13; lokace 13q12.3), které je důležité pro stanovení genetické predispozice na nádory prsní žlázy a s tím spojeného rizika tohoto onemocnění u zdravých příbuzných nemocné ženy.
Příklad 2: U 32- leté pacientky byl diagnostikován karcinom prsu a ovarií (obrázek 12, jedinec III1 - proband označen šipkou).
Obrázek 12 - Genealogická analýza familiárního výskytu karcinomu prsu
Byly provedeny molekulárně-genetické analýzy s pomocí PCR a následného určování sekvence nukleotidů v genech BCRA1 a BCRA2. Vyšetření prokázaly přítomnost mutace genu BCRA1 v genotypu pacientky, která je spojena se zvýšeným rizikem vzniku tohoto onemocnění. Tato informace měla zásadní význam nejen pro následnou terapii pacientky, ale i pro její rodinu.
Po provedení genealogické analýzy bylo zjištěno, že babička probanda z matčiny strany (I2), která zemřela krátce před dosažením šedesátého pátého roku života, měla v 56. roce života diagnostikovaný karcinom prsu. Ze tří biologických dětí této ženy (jednu dceru měla adoptivní) se riziková mutace genu BRCA1 projevila u nejstaršího syna a u nejmladší dcery, která je matkou vyšetřené pacientky-probanda. Nejstarší syn (II1) měl v 41. roku svého života diagnostikovaný karcinom prsu. Vzhledem k nízké frekvenci karcinomu prsu u mužů a s tím spojeného opožděného diagnostikování nemoci u tohoto muže, jakož i díky nepříznivým psychosociálním faktorům (etylizmus, nižší inteligence) muž zemřel necelé dva roky od stanovení diagnózy. U matky pacientky-probanda bylo diagnostikováno stejné onemocnění, jako u jejího bratra, avšak až v 52. roce jejího života.
Na základě výše uvedených poznatků lze konstatovat, že se jedná o typický familiární výskyt onemocnění s výrazným genetickým podkladem. Tento poznatek je důležitý z hlediska volby správné terapie pro pacientku.
Důležité poznámky:
Genealogická analýza byla v tomto případě důležitá nejen z hlediska managementu léčebně preventivního procesu u pacientky s kombinovaným karcinomem prsu a ovarií. Jak můžeme vidět na obrázku 12, 32- letá pacientka byla vdaná a měla dvě děti, obě dcerky. Vzhledem k familiárnímu výskytu onemocnění karcinomu prsu v rodině je vyšetření těchto dívek velmi důležité pro stanovení prognózy možného vzniku onemocnění.
Z příkladu 1 je zřejmá ještě jedna důležitá věc, kterou je vzájemná kombinace a vzájemné doplňování laboratorních vyšetřovacích metod v genetice. V tomto konkrétním případě byla nutná kombinace přístupů molekulární genetiky a genealogické analýzy.
Pokud jsme dosud hovořili o "stanovení genotypu", mysleli jsme tím výlučně genotyp člověka - pacienta, kterému byl odebrán vzorek (např. periferní krev) pro stanovení alelové sestavy pro konkrétní sledovaný gen. Z širšího pohledu nás však musí zajímat i genetický materiál, který není primárně lidského původu, avšak má významný vliv na jeho zdraví. Proto se stanovují i varianty genetické informace patogenů, ačkoli v jejich případě je slovní spojení "stanovení genotypu" zavádějící.
Genetická informace virů, jakými jsou např. virus hepatitidy typu C (hepatitis C virus - HCV) nebo virus lidského papilomu (human papilloma virus - HPV) není ve své velikosti, organizaci ani struktuře identická s eukaryotní diploidní sestavou genotypu člověka s jadernou i mimojadernou dědičností. Tato dvojznačnost může vést k nedorozuměním a nesprávné interpretaci výsledků laboratorních vyšetření. Na příkladu 3 uvádíme principy vyšetření "genotypů" HPV právě proto, že se nejedná o oblast humánní genetiky v jejím klasickém pojetí a jde spíše o aplikace molekulární biologie a genetiky z pohledu mikrobiologie, resp. hygieny a epidemiologie. Je však nepopiratelný fakt, že vyšetření HPV má často pro osud pacientky zásadní význam (příklad 3).
Příklad 3: Karcinom děložního čípku se u žen vyskytuje statisticky nejčastěji mezi 35 a 45 rokem života, přičemž druhý výraznější nárůst zaznamenaly epidemiologické studie mezi 65 a 75 rokem života. Incidence onemocnění se pohybuje přibližně na úrovni 1: 6500. Výrazně vyšší výskyt onemocnění je u rizikových skupin žen (prostituce, výskyt pohlavně přenosných infekcí), jakož i v nižších ekonomicko-sociálních skupinách se špatnou hygienou mužů.
Vznik karcinomu prsu je statisticky spojen s výskytem HPV. Netýká se však všech variant jeho genetické informace, tzv. "genotypů HPV" (je jich přes sto), ale pouze některých z nich. Nazývají se jako rizikové genotypy, jejichž přítomnost je nejčastěji potvrzena v invazivních karcinomech děložního čípku. Jde o HPV 16 (přibližně 80 % případů), HPV 18 (něco přes 5 % případů) a zbytek tvoří převážně HPV 31, HPV 33 a HPV 35. Uvádí se, že pouze asi 10 % karcinomů cervixu neobsahuje HPV.
Přesný mechanismus působení viru HPV a jeho ovlivnění vnějšími faktory (kouření, antikoncepce, koinfekce jinými viry apod.) ještě není znám, ačkoli už vědci mají značné informace.
V případě vyšetření pacientky proto mohou nastat tři možnosti:
1 / Není přítomen žádný HPV. Vysvětlení může být dvojí. Nejpravděpodobnější je, že vyšetřená žena ještě neměla pohlavní styk, nebo při pohlavním styku nebyla infikovaná žádnou variantou HPV. V tomto případě však musíme brát v úvahu i možnost tzv. falešné negativity, způsobené např. nevhodným nebo nesprávným odběrem vzorku v ambulanci gynekologa, který negativně ovlivní i výsledek laboratorního testování.
1 / Není přítomen žádný HPV. Vysvětlení může být dvojí. Nejpravděpodobnější je, že vyšetřená žena ještě neměla pohlavní styk, nebo při pohlavním styku nebyla infikovaná žádnou variantou HPV. V tomto případě však musíme brát v úvahu i možnost tzv. falešné negativity, způsobené např. nevhodným nebo nesprávným odběrem vzorku v ambulanci gynekologa, který negativně ovlivní i výsledek laboratorního testování.
2 / Laboratorní vyšetření potvrdí přítomnost variantu HPV, který není rizikovým faktorem pro vznik karcinomu děložního čípku.
3 / Vyšetření potvrdí přítomnost rizikové varianty HPV.
V některých případech může být vyšetření ztížené koinfekcí více variantami HPV (přítomností více "genotypů" ve vzorku). V tomto případě je nutné rozeznat, zda se mezi nimi nachází riziková varianta viru.
Jednou z prvních metodik stanovení viru HPV bylo stanovení konformačního polymorfismu jednotlivých řetězců, které tvoří dvouřetězcovou DNA (angl. single strand conformational polymorphism, SSCP). Principem metody je poznatek, že v případě denaturace DNA (rozpletení dvoušroubovice uvolněním vodíkových vazeb mezi páry bází) a následné elektroforézy se dají rozeznat oba řetězce DNA. Podle toho, o jaký genotyp se jedná, vytvářejí se na gelu specifické uspořádání pruhů, charakteristické pro jednotlivé varianty HPV. V tomto případě se pro namnožení (amplifikaci) sledované DNA použije PCR, po které však nenásleduje zpracování restrikčních endonukleázy (viz příklad 1), ale získaná DNA se tepelně zdenaturuje (rozloží) na dva samostatné řetězce a provede se elektroforeticky separace v stejnosměrném elektrickém poli.
Na závěr této kapitoly se chceme věnovat dvěma velmi klíčovým aspektům, které ovlivňují ošetřovatelskou péči. Jsou jimi spolehlivost získaných výsledků genetických laboratorních vyšetření a zásady spolupráce mezi ošetřujícím personálem a laboratorními diagnostiky.
Na rozdíl od ostatních laboratorně vyšetřovaných parametrů (ionty, transaminázy, krevní obraz apod.) mají molekulárně-biologické metody jednu nevýhodu, kterou je, paradoxně, stabilita genotypu člověka. Pokud například stanovíme 15- leté dívce v jejím genotypu přítomnost rizikové alely genu BRCA1, tak přesně tutéž alelu musíme stanovit u dané ženy i opakovaně, byť o 30 let později. Genetická informace je tedy stálá. Jiné ovšem je, pokud sledujeme expresi (projev) sledovaného genu, kdy můžeme intenzitu transkripční aktivity genu kvantifikovat (např. u nádorových onemocnění). V tomto případě se však jedná o několik málo vysoce specializovaných pracovišť, které se této diagnostice věnují.
Aby genetická laboratoř dosáhla požadovanou spolehlivost, řídí se přesně určenými předpisy, zásadami a má vypracované přesné postupy analýzy. Tyto postupy se označují jako standardní operační postupy. Jejich důležitou součástí je tzv. interní a externí řízení kvality.
Interní řízení kvality (angl. Internal quality control), často nesprávně překládané jako interní kontrola kvality) spočívá v používání vzorků se známým genotypem, které jsou vyšetřovány v sérii spolu s neznámými vzorky pacientů. Pokud je výsledkem analýzy jiný genotyp kontrolního vzorku, než jaký byl ověřen, analýza se musí zopakovat. Kromě této tzv. pozitivní kontroly se používá i negativní kontrola. Její principem je provedení celé molekulárně-genetické analýzy na vzorku, který je zcela shodný s ostatními s jedinou výjimkou - neobsahuje DNA. Pokud přesto, že ve vzorku není DNA, získáme jakýkoliv výsledek, je zřejmé, že došlo ke kontaminaci vzorku a molekulárně-genetické vyšetření je nutno zopakovat.
Externí řízení kvality (angl. external quality control) spočívá ve vyšetření vzorku, jehož genotyp je laboratoři neznámý, avšak poskytovateli kontroly známý je. Cílem je ověřit, zda laboratoř opravdu stanoví takový genotyp, jaký stanovit má.
Tyto zásady neplatí pouze pro postupy molekulární genetiky, ale i pro cytogenetické vyšetření. V tomto případě dostane laboratoř snímku cytogenetická preparátu neznámého jedince a úlohou cytogenetika je stanovit správný karyotyp. Je pochopitelné, že v tomto případě nestačí zhodnotit jediný preparát, ale většinou 20 a více. I v tomto případě externí řízení kvality kopíruje požadavky na cytogenetické vyšetření tak, že vyšším počtem vyšetřených preparátů jediného pacienta se potvrdí nález a eliminuje se možnost falešného výsledku např. v případě mozaiky.
Poznámka:
Genetická mozaika je stav, kdy se u pacienta nacházejí buňky a tkáně s různým genetickým materiálem. Většinou je to v důsledku somatické mutace během ranní embryogeneze. Platí, že čím dříve se v průběhu vývoje jedince mutace vyskytne, tím větší počet somatických buněk ji bude obsahovat. Přirozený výskyt mozaicizmu (tj. bez mutační změny) je u člověka velmi vzácný a byl popsán v případech anomálií vzájemného ovlivnění plodů (např. dvojčat) v průběhu těhotenství.
Genetická mozaika je stav, kdy se u pacienta nacházejí buňky a tkáně s různým genetickým materiálem. Většinou je to v důsledku somatické mutace během ranní embryogeneze. Platí, že čím dříve se v průběhu vývoje jedince mutace vyskytne, tím větší počet somatických buněk ji bude obsahovat. Přirozený výskyt mozaicizmu (tj. bez mutační změny) je u člověka velmi vzácný a byl popsán v případech anomálií vzájemného ovlivnění plodů (např. dvojčat) v průběhu těhotenství.
Jak vidíme, systém laboratorních vyšetření je nastaven tak, aby zaručil poskytování validní výsledků. Terapeutický proces je však vždy týmová práce, kde zázemím pro ošetřující personál jsou laboratorní diagnostické složky. Proto je velmi důležitá správná komunikace mezi nimi.
Z pohledu vyšetřovacích metod by měl ošetřující personál (především sestra) vědět následující obecné zásady:
- Kvalita výsledku laboratorního testování je ekvivalentní kvalitě vzorku, kterou laboratoř dostane.
- Odběr vzorků pacienta by se měl provést takovým způsobem a do takového odběrového materiálu, jaký doporučuje laboratoř, která provádí molekulárně-genetické, imunogenetické nebo cytogenetické vyšetření. Nedodržení této zásady může výrazně ovlivnit vzorek- ať už jeho stabilitu, nebo způsobilost k provedení laboratorních testů.
Poznámka: Je samozřejmě možné použít v případě nouze i jiný odběrový materiál, ale bylo by vhodné to předem konzultovat. Naopak, pracovníci laboratoří by měli mít přehled o odběrových systémech na trhu, aby věděli v takovém případě erudovaně poradit.
- Po odběru vzorku je nutné jej co nejdříve doručit do laboratoře, abychom se vyhnuli riziku jeho znehodnocení.
- V případě stanovení genotypu u pacienta není možné po čase získat jiný výsledek (výjimkami jsou např. transplantace apod.). Z toho vyplývá, že např. přítomnost rizikové alely FVLeiden stačí stanovit jednou a další vyšetření už pravděpodobně nebude zdravotní pojišťovna ochotna hradit.
Výše uvedená pravidla se mohou zdát příliš jednostranně cílené na ošetřující personál. Důvodem je určení této studijní opory právě pro takovou skupinu. Můžeme však studenty ujistit, že např. obory laboratorních vyšetřovacích metod ve zdravotnictví mají diktované stejně tvrdé a striktní pravidla svého chování vůči kolegům z ošetřujícího personálu.
Na závěr této kapitoly můžeme konstatovat, že rozvoj uvedených metod postupuje nadále rychlým tempem a je nadějí pro terapii mnoha onemocnění.
8 Budoucnost využití genetiky ve zdravotnictví
8.4 Testovací otázky
Ačkoliv žijeme v době, kdy je již známa sekvence DNA genomu člověka, důležitých mikroorganismů a patogenů, nemáme právo se domnívat, že hlavní část výhry už máme v rukou. Důvodů na rezervovaný přístup k předčasnému optimismu je několik:
- Známe sice sekvenci nukleotidů v genomu člověka, avšak stále nemáme úplně objasněno fungování regulačních mechanismů, které výrazným způsobem rozhodují o výsledném projevu regulovaných genů. Dodnes nejsou úplně jasné důsledky vlivu dynamických struktur genomu, jako jsou např. transpoziční elementy. Podobných otázek existuje ještě mnoho.
- I když už známe principy sledovaných molekulárně - genetických systémů člověka, častokrát jsou naše možnosti omezeny pouze na diagnostiku aktuálního stavu. Příkladem jsou např. prenatální diagnostika, stanovení rizikových alel, které představují predispozici na závažná onemocnění apod. V drtivé většině případů nejsme schopni s pomocí našeho současného technického potenciálu překročit hranici mezi diagnostickým zjištěním a terapeutickým zásahem na stejné, tj. molekulárně - genetické úrovni. Pokud existuje možnost terapie, stále se většinou jedná o klasické invazivní zákroky (rozštěpy), dietetické nutriční přístupy (fenylketonurie) a medikamentózní terapii (trombofilní stavy v případě mutace FVLeiden).
- I v případě, že máme v rukou přiměřenou technologii, je využití poznatků provázeno intenzivní polemikou především v etické rovině využití genetických a molekulárně - genetických postupů.
Všechny uvedené důvody dokazují, že genetiku ve všech jejích aplikacích čeká ještě dlouhý a hodně dynamický vývoj. V následujících kapitolách bychom chtěli poukázat na základní trendy, které jsou výrazné již dnes a představují budoucnost tohoto oboru a jeho využití z pohledu ošetřujících zdravotnických pracovníků.
8.1 Nanotechnologie
Hlavní trend současného vývoje laboratorních vyšetřovaných metod, ke kterým patří i genetické a molekulárně-genetické testování, se vyvíjí především směrem k automatizaci a miniaturizaci. To je předpokladem pro urychlení analýz a minimalizaci lidského faktoru jako hlavní příčiny hrubých a náhodných chyb.
Miniaturizace laboratorních analýz zároveň vytváří reálný předpoklad pro výrazné zvýšení množství vzorků nebo genů, které jsou vyšetřovány současně. Znamená to, že pokud pátráme po rizikové alele jediného genu, můžeme vyšetřit větší počet pacientů najednou. Pokud chceme naopak vyšetřit u jediného pacienta přítomnost alel několika genů nebo jejich aktivitu, rovněž to můžeme provést současně.
Dalším nezanedbatelným rysem těchto metod je jejich příklon k tzv. "suché fázi". Všichni studenti si jistě pamatují na praktické hodiny v chemické laboratoři. Chemické reakce byly téměř výhradně prováděny ve zkumavkách. Jinými slovy, tyto reakce probíhaly v homogenním, kapalném prostředí. Na této bázi byla postavena nejen "klasická" klinická biochemie, ale také molekulárně-genetická diagnostika (viz kapitoly 7.3 Biochemická genetika a 7.4 Molekulárně genetické metody).
V současnosti již pokrok zašel dál. Dnes se rutinně využívají testovací systémy, které nejsou založeny na chemické reakci v homogenním kapalném prostředí. Příkladem je např. stanovení glykémie s pomocí kapesních analyzátorů. Kapka vzorku se nanese na suchý testovací proužek. Na něm jsou pevně navázány všechny potřebné komponenty (enzymy) a po přidání vzorku se přístrojem stanoví míra změny fyzikálně-chemických parametrů, která je úměrná koncentraci stanovovaného parametru. Podobný rozvoj se udál i v oblasti molekulárně - genetických metod a vyústil do vývoje DNA-čipů (DNA-mikročip, angl. DNA-microarray).
Základem vývoje těchto metod je schopnost dvou oddělených DNA-řetězců (nebo i RNA - řetězců) spárovat se do jediné dvoušroubovicové molekuly DNA. Je to možné tehdy, pokud jsou oba řetězce vzájemně komplementární (viz kapitola 2.2 Nukleové kyseliny). Mezi jednotlivými bázemi se vytvoří vodíkové vazby ve smyslu Chargaffových pravidel: adenin se spojí dvěma vodíkovými vazbami s tyminem a cytosin se spojí třemi vodíkovými vazbami s guaninem. K tomuto ději dochází úplně přirozeně např. v průběhu transkripce. Syntéza RNA se tehdy děje podle jednoho ze dvou řetězců, které se po dokončení procesu znovu spojí do jediné dvouřetězcové molekuly DNA.
K spárování však může dojít i v případě, že oba řetězce jsou sice komplementární, ale liší se svým původem. Pokud uměle vytvoříme (nově syntetizujeme) řetězec DNA, ten se může stejně spolehlivě navázat na druhý řetězec DNA, který pochází z buňky člověka. Jedinou podmínkou pro tento proces je již zmíněná komplementarita řetězců. Proces tvorby dvoušroubovice, která vznikla spárováním dvou řetězců různého původu, nazýváme hybridizace. Samotnou dvoušroubovicovou molekulu DNA, která vznikla tímto způsobem, nazýváme heteroduplex.
V devadesátých letech minulého století došlo k rozvoji prvních hybridizačních technik. Na pevný podklad (např. nylonovou membránu) se ukotvili (např. působením vyšší teploty) řetězce DNA (tzv. sonda). Následně se k nim přidali vzorky, které obsahovaly denaturovanou DNA (tj. s oddělenými řetězci) značenou radioaktivně nebo fluorescenčně. Pokud se ve vzorku DNA nacházela sekvence bází, která byla komplementární se sekvencí navázané DNA-sondy na membráně, vytvořila se dvoušroubovice. Její vznik se ověřil určením přítomnosti signálu na membráně (radioaktivního záření nebo fluorescence).
Uvedený postup je příkladem tzv. Southernovy hybridizace, tj. hybridizace dvou řetězců DNA. Hybridizace řetězců RNA se nazývá northernová hybridizace. Tato klasická, manuální technika dovoluje testovat najednou několik desítek vzorků.
Miniaturizace a robotizace celého procesu vedli k metodikám DNA – microarrays, které jsou využívány v dnešní době. Jejich princip je v podstatě stejný jako u klasické hybridizace (obrázek 13).
Na pevnou podložku se nanese tzv. sonda, kterou tvoří krátké řetězce DNA (tzv. oligomery). Ty obsahují pouze několik desítek nukleotidů. Díky miniaturizaci celé technologie je možné najednou ukotvit až několik desítek tisíc různých sond, které jsou jako pravidelná struktura bodů rovnoměrně rozloženy na skleněném nosiči (obrázek 13). Po nanesení vzorku s neznámou DNA, která je fluorescenčně značená, nastává hybridizace. Ta proběhne pouze tehdy, pokud jsou sekvence nukleotidů řetězců DNA ve vzorku komplementární se sekvencí nukleotidů DNA sondy. Po excitaci světlem o vhodné vlnové délce vyzáří molekula fluoroforu, kterou je vzorek označen, světlo se specifickou barvou (tj. o specifické vlnové délce). Podle intenzity tohoto světla lze určit, zda k hybridizaci došlo, a v jaké míře. Pochopitelně, i tato metodika má ještě nevyřešené problémy. Mezi ně patří zejména:
- Vysoká finanční nákladnost vyšetření, která brání jeho většímu rozšíření v rutinní genetické diagnostice a zůstává doménou specializovaných pracovišť,
- technické nedostatky, jakými jsou poměrně vysoká míra pozadí signálu, která vadí hlavně v případě slabého vyzářeného světla. Důsledkem je nedostatečná senzitivita. Dále jsou to problémy statistického vyhodnocení výsledků.
- Metodologické problémy charakterizuje zejména nedostatečná standardizace postupů a obtížná reproducibilita (opakovatelnost vyšetření).
Naopak, mezi slibné výhody, které metodika poskytuje, patří především:
- Výrazný rozvoj testování genové exprese v rámci farmakoterapie, která by byla přizpůsobena geneticky-metabolickým specifikům pacienta,
- několikanásobné zvýšení kapacity a rychlosti vyšetření, v důsledku čehož se celý proces vyšetření vzorků pacientů výrazně zrychlí,
- komplexnost vyšetření genotypu jedince, důsledkem čeho vzroste diagnostická výpovědní hodnota vyšetření se zpětným vlivem na léčbu a celkovou prognózu pacienta.
Poznámka: hybridizační techniky, které jsou založeny na vzájemné komplementaritě párování bází dvou řetězců DNA různého původu, nejsou doménou pouze molekulární genetiky. V kapitole 7.2 Cytologická analýza jsme se zabývali způsoby vizualizace a vyšetření chromosomů. Významnou podmínkou proužkovacích technik je kultivace buněk ze vzorku pacienta a zastavení jejich dělení v metafázi mitózy. Tento požadavek nevyžaduje metoda FISH (fluorescenční hybridizace in situ, z ang. fluorescence in situ hybridization). V tomto případě se buňky ze vzorku pacienta nemusí zpracovat tak, aby byly viditelné spiralizované chromosomy v metafázi. Po fixaci buněk v interfázi a použití fluorescenčně značené sondy (jednořetězcová DNA) se v případě její vazby na DNA preparátu potvrdí přítomnost sekvence DNA, kterou ve vzorku hledáme. Tímto způsobem se může ověřit např. přítomnost trizómií nebo chromozomálních aberací. FISH má díky tomu značné uplatnění také v reprodukční medicíně, protože v případě asistované reprodukce je množství biologického materiálu ve vzorku značně omezené a neumožňuje provést klasickou cytogenetickou analýzu.
Obrázek 13 - Princip DNA – microarray
Výrazný pokrok lze sledovat také ve vývoji zobrazovacích metod. Mikroskopie atomárních sil (z angl. atomic force microscope, AFM; synonymní název scanning force microscope, SFM) je v současnosti používána a testována v primárním výzkumu v biologii a genetice. Schopností rozlišení struktury vzorku (několik nm) se přibližuje možnostem elektronové mikroskopie a podstatně převyšuje možnosti optického mikroskopu.
Metoda se liší od optického mikroskopu (a také od transmisního elektronového mikroskopu) tím, že zobrazuje pouze povrch fixovaného vzorku (jako např. skenovací elektronová mikroskopie, SEM). Na rozdíl od SEM však nevyžaduje náročnou přípravu vzorek a dokáže pracovat v přirozeném prostředí biologických molekul. Pro DNA nebo RNA je přirozeným prostředím kapalné prostředí. Nukleové kyseliny mají totiž mimo jiné na svém povrchu z molekul vody vytvořenou jakousi "hydratační páteř" (angl. spin of hydration). Proto je studium jejich struktury v přirozeném prostředí velmi důležité.
Principem metody (obr. 14) je využití miniaturního ostrého hrotu, který je upevněn na ohebném nosníku. Druhý konec nosníku je pevně ukotven. Hrot se rovnoměrně pohybuje těsně nad povrchem vzorku (molekuly DNA, proteinu, hormonu apod.). Díky malé vzdálenosti mezi hrotem a vzorkem působí na hrot elektrostatické síly, které v závislosti na konkrétní struktuře rozkmitají ohebný nosník s hrotem. Kmitání, způsobeno atomárními sílami, je zachyceno laserovým paprskem a následně převedeno do trojrozměrného obrazu.
Obrázek 14 - Princip mikroskopie atomárních sil
Metoda je stále ještě ve vývoji a uvedený princip je pouze hrubým náčrtem jejích potenciálních možností. Bude však nutné odstranit nejvážnější nedostatky, kterými jsou malý rozsah velikosti snímaného pole (velikosti obrazu), pomalost snímání a deformity obrazu.
Oba uvedené příklady metod jsme vybrali proto, že už dnes jsou výrazně rozpracovány i po metodické stránce. Z hlediska potenciálu jejich využití v genetice představují slibnou perspektivu. Pochopitelně, existuje mnohem širší spektrum vyvíjených nanotechnologických aplikaci. Jejich rutinní zavedení v genetice je však ještě otázkou dlouhého vývoje a výzkumu.
8.2 Molekulární medicína
Molekulární medicína je vědní obor, integrující aplikace nejnovějších poznatků z biofyziky, chemie, biochemie, genetiky a molekulární biologie. Jeho cílem je získávat a využívat informace o molekulárních strukturách a mechanismech s cílem vyvinout terapeutické a intervenční metody a postupy na molekulární úrovni. Příkladem využití poznatků z genetiky v molekulární medicíně je vývoj tzv. genové terapie. Pod tímto pojem se obecně rozumí terapeutický postup, při němž je do genomu pacienta vpravena cizí sekvence DNA (obrázek 15). Genetická informace, kterou cizí DNA nese, zpravidla nahrazuje poškozenou, chybějící nebo nefunkční genetickou informaci v genomu pacienta. Tato situace může nastat zpravidla vlivem mutací.
Příklad 1. První úspěšnou genovou terapii provedl tým, který vedl Dr. French Anderson v National Heart, Lung and Blood Institute v USA v roce 1990. Pacientkou byla čtyřletá holčička Ashanti DeSilva. Narodila se s deficitem enzymu adenosin deamináza (dále ADA), v jehož důsledku trpěla těžkou imunodeficiencí. Nefunkční enzym ADA u pacientů způsobuje hromadění deoxyadenosinu, které vede k inhibici syntézy DNA. Ta se nejvíce projevuje v mitoticky aktivních buňkách, jako jsou např. prekurzory B a T lymfocytů. Kromě toho, dalším z důsledků nefunkčního enzymu ADA je zvýšení koncentrace S-adenozylhomocysteinu, který rovněž působí toxicky na nezralé lymfocyty. Tato porucha byla způsobena autozomálně recesivní mutací genu pro zmíněný enzym. Vzhledem k závažnosti zdravotního stavu pacientky se její rodiče rozhodli podstoupit rizika genové terapie. Tým specialistů jí odebral leukocyty, které byly dále kultivovány a s pomocí tzv. nosiče (v tomto případě retroviru) byla do nich vnesena DNA s funkčním genem pro enzym ADA. Takto upravené buňky byly po kultivaci vpraveny zpět do těla pacientky. Ashanti DeSilva žije dodnes.
Obrázek 15 - Princip genové terapie
Bohužel, tato metoda zatím zůstává pouze doménou výzkumu. Její aplikaci do klinické praxe brzdí především ne zcela zvládnutá technologie způsobu vpravení do organismu pacienta a možné selhání integrace nukleové kyseliny s funkční kopií genu do složitého systému řízení exprese genů v genomu pacienta.
Příklad 2. Jedním z prvních veřejně známých případů nezdařené genové terapie je považován Jesse Gelsinger. Trpěl deficiencí enzymu ornitin transkarbamyláza. Gen pro tento enzym je umístěn na chromosomu X. Zvláštností tohoto případu bylo, že u pacienta tato mutace vznikla až v průběhu embryonálního vývoje. Z genetického hlediska se tudíž jednalo o mozaiku (viz poznámky v kapitole 7.4 Molekulárně genetické metody), proto onemocnění nemělo v tomto případě obvyklý letální průběh. V rámci terapie byl pacientovi podán vektor (adenovirus) s funkční kopií DNA genu pro ornitin transkarbamylázu. Pacient bohužel zemřel o čtyři dny později ve svých osmnácti letech.
Přes všechny zmíněné nedostatky představuje genová terapie příslib nových terapeutických možností v relativně blízké budoucnosti.
Příklad 3. V prosinci roku 2011 byla týmem britských specialistů publikována v časopise New England Journal of Medicine úspěšná genová terapie čtyř pacientů s hemofilií B. Výsledkem terapeutického postupu bylo obnovení syntézy koagulačního faktoru IX u všech pacientů bez nutnosti jeho injekční suplementace.
Důležité poznámky:
- Z obrázku 15 vyplývá, že v případě úspěšně provedené genové terapie zůstává naživu recesivní homozygot, který by bez terapeutického zásahu zemřel anebo byl do konce života odkázán na terapii. V případě sňatku vyléčené holčičky s genotypově zdravým mužem bude všechno její potomstvo tvořeno heterozygoty, kteří budou mít jednu mutantní recesivní alelu. Je tomu tak proto, že genovou terapií byla pozměněna pouze část somatických buněk pacientky. V tomto případě bohužel nebyla ovlivněna genetická informace v prekurzorech pohlavních buněk – gamet. Vidíme, že genová terapie z hlediska genetiky populací může zvyšovat v populaci podíl mutantních alel díky potomstvu vyléčených jedinců, kteří budou (v toto konkrétním případě) heterozygotní nosiči bez patologických klinických projevů. To může v konečném důsledku vést k nárůstu pacientů – recesivních homozygotů, kteří budou vyžadovat genovou terapii. Jediným teoreticky proveditelným řešením, které by v budoucnosti umožnilo kompenzovat poškozenou genetickou informaci ve všech buňkách člověka, je genová terapie v raných stadiích prenatálního vývoje. Tato možnost je ovšem spojena s velkými etickými dilematy (viz kapitola 8.3 Etické problémy), protože přímo zasahuje do integrity lidské bytosti a jejího rozmnožování.
- Terapeutický princip, uvedený na obr. 15 se nedá aplikovat v případě mutantních alel s dominantním projevem. Dominantní mutantní alela (s chybějící a/nebo pozměněnou funkci proteinového produktu) se projeví už v heterozygotním stavu. Jedinou možností medicínské aplikace genetiky je pouze prenatální skríning v případě pozitivní rodinné anamnéze výskytu choroby (např. Huntingtonova chorea).
8.3 Etické problémy
Zavedením genetických a molekulárně – genetických metod přineslo řadu morálních i právních otázek. Důvodem je fakt, že aplikace této vědní disciplíny ve zdravotnictví přímo zasahuje nejen do lidské reprodukce, ale také do genetické jedinečnosti a neopakovatelnosti lidské bytosti. Z toho vyplývají dva závažné okruhy problémů:
Problém integrity jedince: U dospělých osob platí, že léčebný a/nebo diagnostický úkon je možné provádět pouze s informovaným souhlasem pacienta. Vzhledem k tomu, že genetika téměř vůbec nevyužívá urgentní výkony zachraňující život, není nutno uvažovat o tzv. předpokládaném souhlasu pacienta (např. bezvědomí apod.). Dospělá osoba však musí být k poskytnutí informovaného souhlasu kompetentní. V případě, že tato podmínka splněna není (např. u psychicky postiženého pacienta) stanovuje legislativa ČR nutnost informovaného souhlasu jejího zákonného zástupce. Totéž pravidlo platí i v případě neplnoletých osob.
V případě prenatálního vývoje člověka (embryo, plod) je situace mnohem složitější. Právní řád ČR považuje tyto stadia za součást těla matky. Právní subjektivitu získává teprve živý novorozenec. Neexistuje jasně definována priorita práv různých subjektů v případě kritických situací. Nejčastěji jde o právo nenarozeného dítěte na život, které je v rozporu s matčiným právem na život anebo právo na život nenarozeného dítěte s postižením.
Problém bezpečnosti osobních dat: Genetické testování může být hrozbou i pro socioekonomický status jedince. V případě zveřejnění zjištění přítomnosti rizikové alely pro onemocnění u zdravého jedince ho tato informace znevýhodňuje ve srovnání s nositeli standardní genetické informace. Důsledkem může být diskriminace ze strany zaměstnavatele, komerčních pojišťoven i širší společnosti.
Z hlediska zaměstnavatele i pojišťoven je problém pochopitelně opačný. Poskytování stejných podmínek lidem s různou genetickou predispozicí přináší vyšší riziko ekonomických výdajů.
Příklad 1. Huntingtonova choroba (nebo tzv. Huntingtonova chorea) je dědičné neurodegenerativní onemocnění mozku. Je zajímavé, že se dědí autozomálně dominantně. Na chromosomu č. 4, lokaci 4p16.3 se nachází gen HTT, který kóduje protein zvaný huntingtin. Mutovaná alela tohoto genu nese více než 37 tripletů CAG pro aminokyselinu glutamin (pro srovnání viz tab. 1), zatím co normální alela pouze 9 až 36 těchto tripletů. Není ještě zcela známá jeho biologická funkce, s určitostí však víme, že čím více tripletů CAG pro glutamin mutantní alela nese, tím dříve se projeví neurologické i psychiatrické symptomy choroby. Typická je mentální degradací pacientů s postupnou ztrátou kognitivních funkcí, poruchami chování, demencí a poruchami koordinace pohybu (tzv. chorea). Průměrný věk, ve kterém začínají první symptomy choroby u pacientů, se pohybuje přibližně v intervalu 30–40 let. Průměrná doba přežívání pacientů od prvních příznaků činí 10–25 let.
Vidíme, že choroba postihuje především jedince v nejlepším produkčním věku, často s rodinným zázemím a dětmi. Vzhledem k tomu, že se v případu genu HTT jedná o autozomálně dominantní dědičnost, onemocnění hrozí všem nositelům mutantní dominantní alely.
Je proto jasné, že v případě diagnostikování dominantní mutantní alely u mladého zdravého osmnáctiletého člověka budou náklady na jeho zdravotní péči v budoucnosti mnohem vyšší ve srovnání s průměrem jeho vrstevníků.
Aplikace genetiky v medicíně se musí řídit základními etickými principy, které vedle Hippokratovy přísahy definují současné pojetí mezinárodní a evropské legislativy (tabulka 7). Jsou to principy: beneficience, non-maleficience, spravedlnosti, autonomie, solidarity, subsidiarity, transparentnosti a opatrnosti.
Tabulka 7 Základní etické principy v aplikaci genetiky v medicíně
Princip |
Požadavky |
Beneficience |
Veškeré diagnostické a terapeutické postupy musí sloužit k prospěchu pacienta. |
Non-maleficience |
V průběhu diagnostiky i terapie pacienta se zdravotničtí pracovníci musí zdržet jednání, které je spojeno s rizikem poškození pacienta (např. prodlužování života pacienta v terminálním stadiu nemoci za každou cenu bez ohledu na jeho utrpění). |
Spravedlnosti |
Diagnostika a terapie je u všech pacientů vykonávána spravedlivě, bez diskriminace. |
Autonomie lidské bytosti |
Zdravotník musí respektovat jedinečnost pacienta jako lidské bytosti, která má právo rozhodovat o svém zdraví. |
Solidarity |
Systém zdravotnictví musí poskytnout přiměřenou diagnostiku a léčbu všem, kteří to potřebují. |
Subsidiarity |
Problémy je nutno řešit na co možná nejnižší úrovni organizace řízení zdravotní péče. |
Transparentnosti |
Všechny procesy rozhodování je nutno vykonávat transparentně s možností veřejné kontroly (např. obstarávání diagnostické techniky a přístrojového vybavení pro molekulárně–genetickou laboratoř). |
Opatrnosti |
V případě nepřiměřeně vysokého rizika pro pacienta je nutno pozdržet se zamýšleného konání (např. zavádění nových terapeutických metod apod.). |
Kromě toho, na mezinárodním poli vznikla řada dohod a úmluv, cílem kterých je stanovení hranic pro aplikace poznatků z genetiky ve zdravotnictví (tabulka 8).
Tabulka 8 Nejdůležitější mezinárodní úmluvy, které mají dosah na aplikace genetiky ve zdravotnictví
Rok |
Organizace |
Název |
1948 |
WMA |
Ženevská deklarace |
1949 |
WMA |
Mezinárodní kodex lékařské etiky |
1964 |
WMA |
Helsinská deklarace práv pacienta |
1997 |
UNESCO |
Všeobecná deklarace o lidském genomu a lidských právech |
1997 |
RE |
Mezinárodní dohovor o lidských právech a biomedicíně |
1998 |
Dodatkový protokol o zákazu klonování člověka | |
2003 |
Dodatkový protokol o transplantacích | |
2005 |
Dodatkový protokol o biomedicínském výzkumu | |
2008 |
Dodatkový protokol o genetickém testování v medicíně |
Legenda: WMA – World Medical Association (Světová asociace lékařů); RE – Rada Evropy
Vývoj v oblasti biotechnologií pečlivě sleduje i legislativa České republiky. Přehled klíčových právních norem je uveden v tabulce 9. Ústava České republiky tvoří pilíř právní soustavy státu a v návaznosti na mezinárodní úmluvy definuje také základní lidská práva.
Tabulka 9. Klíčové právní normy České republiky pro aplikaci genetiky ve zdravotnictví
Zákon č. |
Název |
1/1993 Sb. |
Ústava České republiky |
101/2000 Sb. |
Zákon o ochraně osobních údajů a o změně některých zákonů |
372/2011 Sb. |
Zákon o zdravotních službách a podmínkách jejich poskytování |
373/2011 Sb. |
Zákon o specifických zdravotních službách |
296/2008 Sb. |
Zákon o zajištění jakosti a bezpečnosti lidských tkání a buněk určených k použití u člověka a o změně souvisejících zákonů (zákon o lidských tkáních a buňkách) |
285/2002 Sb. |
Zákon o darování, odběrech a transplantacích tkání a orgánů a o změně některých zákonů (transplantační zákon) |
Z hlediska přímé aplikace genetických technologií je rozhodující zákon č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách (tabulka 10). Zákon nedovoluje svévolnou genetickou manipulaci s lidskými embryi (§28-30), definuje složení, kompetence a úkoly etických komisí (§38), stanovuje rámec pro ověřování dosud klinicky nezavedených metod (§33-37) a definuje využití asistované reprodukce (§3-§11).
Tabulka 10 Právní rámec klíčových aplikací genetiky ve zdravotnictví ve znění Zákona č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách
Hlava |
Díl |
Paragraf |
Oblast |
II |
1 |
3-12 |
Asistovaná reprodukce |
2 |
12-16 |
Sterilizace | |
3 |
17-20 |
Terapeutická kastrace, testikulární pulpektomie | |
4 |
21-23 |
Změna pohlaví transsexuálních pacientů | |
6 |
28-30 |
Genetické vyšetření | |
III |
- |
33-40 |
Ověřování nových postupů použitím metody, která dosud nebyla v klinické praxi na živém člověku zavedena |
Závěrem této kapitoly můžeme konstatovat, že uvedené okruhy nevyřešených a kontroverzních etických problémů jsou typickým průvodním jevem genetiky proto, že se jedná o relativně novou a rychle se rozvíjející zdravotnickou disciplínu. Definitivní řešení všech stávajících otázek a problémů přinese až čas.
9 Seznam klíčových slov
A
Genetika - A
Pojem |
Kapitola |
A |
|
aberace chromosomové |
5.1 Klasifikace mutací |
aberace chromatidové |
5.1 Klasifikace mutací |
adenin |
2.2 Nukleové kyseliny |
adenylátcykláza |
3.4 Regulace genové exprese |
aditivita |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
AFM |
8.1 Nanotechnologie |
alela |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
alela dominantní |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
alela recesivní |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
alely identické původem |
7.1 Genealogické vyšetření |
alkaptonurie |
7.3 Biochemická genetika |
allozygotní genotyp |
7.1 Genealogické vyšetření |
alogamická populace |
6 Populační genetika |
aminoacyl-tRNA |
3.3 Translace |
aminoacyl-tRNA-syntetáza |
3.3 Translace |
amitóza |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
anafáze |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
aneuploidie |
5.1 Klasifikace mutací |
anortoploidie |
5.1 Klasifikace mutací |
antimediátorová RNA |
3.4 Regulace genové exprexe |
Archibald Garrod |
7.3 Biochemická genetika |
Ashanti De Silva |
8.2 Molekulární medicína |
autogamická populace |
6 Populační genetika |
autozomálně dominantní dědičnost |
7.1 Genealogické vyšetření |
autozomálně recesivně podmíněná hluchoněmota |
7.1 Genealogické vyšetření |
autozomálně recesivní dědičnost |
7.1 Genealogické vyšetření |
autozomy |
2.1 Chromosomy |
autozygotní genotyp |
7.1 Genealogické vyšetření |
B
Genetika - B
Pojem |
Kapitola |
B |
|
Barrovo tělísko |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
Batesonovo číslo „c“ |
4.4. Vazba genů |
bezpečnost osobních dat |
8.3 Etické problémy |
binární dělení |
4.2 Rozmnožování prokaryontních buněk |
bioinformační makromolekuly |
2. Genetická informace
2.2 Nukleové kyseliny |
biologické mutageny |
5.2 Rozdělení mutagenů |
Bloomův syndrom |
5.3 Reparační mechanismy |
BRCA1 |
viz karcinom prsu |
BRCA2 |
viz karcinom prsu |
C
Genetika - C
Pojem |
Kapitola |
C |
|
cAMP |
3.4 Regulace genové exprexe |
CAP |
3.4 Regulace genové exprexe |
coupling |
viz fáze „cis“ |
C-proužkování |
7.2 Cytologická analýza |
cyklin-dependentní kinázy |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
cykliny |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
cytogenetika |
7.2 Cytologická analýza |
cytosin |
2.2 Nukleové kyseliny |
D
Genetika - D
Pojem |
Kapitola |
D |
|
dědičnost |
2. Genetická informace |
dědičnost křížem |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
dědivost |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
delece |
5.1 Klasifikace mutací |
deplece DNA |
5.1 Klasifikace mutací |
dicentrický chromosom |
5.1 Klasifikace mutací |
Dicer |
3.4 Regulace genové exprexe |
diploidní stav |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
DNA |
2.2 Nukleové kyseliny |
DNA-čipy |
8.1 Nanotechnologie |
DNA-microarray |
Viz DNA-čipy |
Downův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
E
Genetika - E
Pojem |
Kapitola |
E |
|
Edwardsův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
efektivní velikost populace |
6 Populační genetika
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
elongace replikace |
3.1 Replikace |
elongace translace |
3.3 Translace |
endomitóza |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
enzymová indukce |
3.4 Regulace genové exprexe |
enzymová represe |
3.4 Regulace genové exprexe |
excizní reparace |
5.3 Reparační mechanismy |
exony |
3.2 Transkripce |
externí řízení kvality |
7.4 Molekulárně genetické metody |
F
Genetika - F
Pojem |
Kapitola |
F |
|
faktor V (proakcelerin) |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
familiární výskyt onemocnění |
7.4 Molekulárně genetické metody |
farmakogenetika |
7.3 Biochemická genetika |
fáze „cis“ |
4.4. Vazba genů |
fáze „trans“ |
4.4. Vazba genů |
fenokopie |
5.2 Rozdělení mutagenů |
fenotyp |
2.3 Koncepce genu |
fenylketonurie |
5.1 Klasifikace mutací
7.1 Genealogické vyšetření |
Filadelfský chromosom |
5.1 Klasifikace mutací |
FISH |
viz fluorescenční hybridizace in situ |
fluorescenční hybridizace in situ |
8.1 Nanotechnologie |
fotoreaktivace |
5.3 Reparační mechanismy |
fyzikální mutageny |
5.2 Rozdělení mutagenů |
G
Genetika - G
Pojem |
Kapitola |
G |
|
G1-fáze |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
G2-fáze |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
gen |
2.3 Koncepce genu |
genetická mozaika |
7.4 Molekulárně genetické metody |
genetické izoláty |
7.1 Genealogické vyšetření |
genetický drift |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
genetický polymorfismus |
7.3 Biochemická genetika |
genofond |
6 Populační genetika |
genotyp |
2.3 Koncepce genu |
genotypové frekvence |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
genotypové určení pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
genová terapie |
8.2 Molekulární medicína |
genové (alelové) frekvence |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
genové určení pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
geny konstitutivní |
3.4 Regulace genové exprexe |
gonozomy |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
G-proužkování |
7.2 Cytologická analýza |
guanin |
2.2 Nukleové kyseliny |
H
Genetika - H
Pojem |
Kapitola |
H |
|
Hardy-Weinbergův zákon |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
HCV |
viz virus hepatitidy C |
hemizygotní stav |
4.5 Genetická informace a pohlaví
7.1 Genealogické vyšetření |
hemofilie |
7.1 Genealogické vyšetření |
hemofilie A |
7.1 Genealogické vyšetření |
hemofilie B |
7.1 Genealogické vyšetření
8.2 Molekulární medicína |
hereditární eliptocytóza |
7.1 Genealogické vyšetření |
heritabilita |
viz dědivost |
heritabilita v širším slova smyslu |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
heritabilita v užším slova smyslu |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
heteroduplex |
8.1 Nanotechnologie |
heterogametické pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
heteroplazmie |
5.1 Klasifikace mutací |
heterotypické dělené buňky |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
heterozygot |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
Hippokratova přísaha |
8.3 Etické problémy |
holandrická dědičnost |
Viz přímá dědičnost |
homeotypické dělení buňky |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
homogametické pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
homoplazmie |
5.1 Klasifikace mutací |
homozygot |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
HPV |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HPV 16 |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HPV 18 |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HPV 31 |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HPV 33 |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HPV 35 |
7.4 Molekulárně genetické metody |
HRT (high resolution techniques) |
7.2 Cytologická analýza |
Huntingtonova chorea |
8.3 Etické problémy |
hybridizace |
8.1 Nanotechnologie |
hypofosfatémie |
7.1 Genealogické vyšetření |
CH
Genetika - CH
Pojem |
Kapitola |
Ch |
|
Chargaffova pravidla |
2.2 Nukleové kyseliny |
chemické mutageny |
5.2 Rozdělení mutagenů |
chí-kvadrátový test |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
chimérismus |
5.1 Klasifikace mutací |
chromosomové určení pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
chromosomy |
2.1 Chromosomy |
chromozomální aberace |
5.1 Klasifikace mutací |
I
Genetika - I
Pojem |
Kapitola |
I |
|
IBD |
viz alely identické původem |
inbrední koeficient |
7.1 Genealogické vyšetření |
inbríding |
7.1 Genealogické vyšetření |
informovaný souhlas pacienta |
8.3 Etické problémy |
iniciace replikace |
3.1 Replikace |
iniciace translace |
3.3 Translace |
iniciační kodon |
3.3 Translace |
integrita jedince |
8.3 Etické problémy |
interfáze |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
interní řízení kvality |
7.4 Molekulárně genetické metody |
introny |
3.2 Transkripce |
inverze |
5.1 Klasifikace mutací |
inverze paracentrická |
5.1 Klasifikace mutací |
inverze pericentrická |
5.1 Klasifikace mutací |
inzerce |
5.1 Klasifikace mutací |
ionizující záření |
5.2 Rozdělení mutagenů |
J
Genetika - J
Pojem |
Kapitola |
J |
|
Jesse Gelsinger |
8.2 Molekulární medicína |
K
Genetika - K
Pojem |
Kapitola |
K |
|
karcinom děložního čípku |
7.4 Molekulárně genetické metody |
karcinom prsu |
7.4 Molekulárně genetické metody |
katabolická represe |
3.4 Regulace genové exprexe |
Klinefelterův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
kód genetický |
3.3 Translace |
kodogenní řetězec |
3.2 Transkripce |
koinfekce |
viz virus lidského papilomu |
kontinuální proměnlivost |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
L
Genetika - L
Pojem |
Kapitola |
L |
|
Leidenská mutace faktoru V |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci
7.4 Molekulárně genetické metody |
leukocyty |
7.2 Cytologická analýza |
lokus |
2.3 Koncepce genu |
lyonizace |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
M
Genetika - M
Pojem |
Kapitola |
M |
|
maskulinní a feminní faktory |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
maternální fenylketonurie |
5.1 Klasifikace mutací |
matroklinita |
viz mitochondriální dědičnost |
meióza |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
Mendelova pravidla |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
metabolická dráha |
7.3 Biochemická genetika |
metafáze |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
metyléntetrahydrofolát reduktáza |
7.3 Biochemická genetika |
migrace |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
mikroskopie atomárních sil |
8.1 Nanotechnologie |
miRNA |
3.4 Regulace genové exprexe |
mitochondriální dědičnost |
7.1 Genealogické vyšetření |
mitochondrie |
2.1 Chromosomy |
mitotické jedy |
7.2 Cytologická analýza |
mitóza |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
model operonový |
3.4 Regulace genové exprexe |
monozomie |
5.1 Klasifikace mutací |
Moragnova pravidla |
4.4. Vazba genů |
Morganovo číslo „p“ |
4.4. Vazba genů |
mozaicismus |
5.1 Klasifikace mutací |
mRNA (mediátorová RNA) |
2.2 Nukleové kyseliny |
mtDNA depleční syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
mutabilita |
5 Mutace a poškození genetické informace |
mutace |
5 Mutace a poškození genetické informace
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
mutace bodová |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace gametické |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace genomové |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace genové |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace chromosomové |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace indukované |
5.2 Rozdělení mutagenů |
mutace letální |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace neutrální |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace přímá |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace somatické |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace spontánní |
5.2 Rozdělení mutagenů |
mutace tichá |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace vitální |
5.1 Klasifikace mutací |
mutace zpětná |
5.1 Klasifikace mutací |
mutageny |
5.2 Rozdělení mutagenů |
N
Genetika - N
Pojem |
Kapitola |
N |
|
negativní kontrola |
7.4 Molekulárně genetické metody |
nondisjunkce chromatid |
5.1 Klasifikace mutací |
NOR-proužkování |
7.2 Cytologická analýza |
nukleozom |
2.1 Chromosomy |
O
Genetika - O
Pojem |
Kapitola |
O |
|
Okazakiho fragmenty |
3.1 Replikace |
operon |
3.4 Regulace genové exprexe |
ortoploidie |
5.1 Klasifikace mutací |
osteomalácie |
7.1 Genealogické vyšetření |
P
Genetika - P
Pojem |
Kapitola |
P |
|
panmixie |
6 Populační genetika |
Pataův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
PCR |
viz polymerázová řetězová reakce |
polyadenylace |
3.2 Transkripce |
polymerázová řetězová reakce (PCR) |
7.4 Molekulárně genetické metody |
polyploidie |
5.1 Klasifikace mutací |
pozitivní kontrola |
7.4 Molekulárně genetické metody |
pravidlo o čistotě gamet |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
pravidlo o nezávislé kombinaci genů |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
pravidlo štěpení znaků |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
pravidlo uniformity a reciprocity |
4.3 Segregace a kombinace vloh |
premutagen |
5.2 Rozdělení mutagenů |
primární poměr pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
princip autonomie |
8.3 Etické problémy |
princip non-maleficience |
8.3 Etické problémy |
princip beneficience |
8.3 Etické problémy |
princip opatrnosti |
8.3 Etické problémy |
princip solidarity |
8.3 Etické problémy |
princip spravelnosti |
8.3 Etické problémy |
princip subsidiarity |
8.3 Etické problémy |
princip transparentnosti |
8.3 Etické problémy |
proband |
7.1 Genealogické vyšetření |
profáze |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
proměnlivost |
2. Genetická informace |
promotor |
3.2 Transkripce |
prstencové (ring) chromosomy |
5.1 Klasifikace mutací |
příbuzenské křížení |
7.1 Genealogické vyšetření |
přímá dědičnost |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
Q-proužkování |
7.2 Cytologická analýza |
R
Genetika - R
Pojem |
Kapitola |
R |
|
rachitida |
7.1 Genealogické vyšetření |
Recklinghausenova nemoc |
viz segmentární neurofibromatóza |
rekombinace |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
reparace zlomu |
5.1 Klasifikace mutací |
replikace semikonzervativní |
3.1 Replikace |
repulsion |
viz fáze „trans“ |
restituce zlomu |
5.1 Klasifikace mutací |
ribozomy |
3.3 Translace |
RISC |
3.4 Regulace genové exprexe |
RNA |
2.2 Nukleové kyseliny |
RNA interference |
3.4 Regulace genové exprexe |
RNA-polymeráza |
3.2 Transkripce |
rodokmen |
7.1 Genealogické vyšetření |
R-proužkování |
7.2 Cytologická analýza |
rRNA |
2.2 Nukleové kyseliny |
řetězec opožďující se |
3.1 Replikace |
řetězec vedoucí |
3.1 Replikace |
S
Genetika - S
Pojem |
Kapitola |
S |
|
Segmentární neurofibromatóza |
7.1 Genealogické vyšetření |
sekundární poměr pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
selekce |
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
semikvantitativní znaky |
6.2 Kvantitativní znaky v populaci |
sestřih |
3.2 Transkripce |
S-fáze |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |
siRNA |
3.4 Regulace genové exprexe |
sociální segregace |
7.1 Genealogické vyšetření |
solenoid |
2.1 Chromosomy |
sonda |
8.1 Nanotechnologie |
spolehlivost získaných výsledků |
7.4 Molekulárně genetické metody |
srpkovitá anémie |
5.1 Klasifikace mutací
6.1 Kvalitativní znaky v populaci |
SSCP |
7.4 Molekulárně genetické metody |
standardní operační postupy |
7.4 Molekulárně genetické metody |
startovací nukleotid |
3.2 Transkripce |
stupeň konsangvinity |
7.1 Genealogické vyšetření |
substituce |
5.1 Klasifikace mutací |
superfemale |
5.1 Klasifikace mutací |
supermale |
5.1 Klasifikace mutací |
syndrom Cri du chat |
5.1 Klasifikace mutací |
T
Genetika - T
Pojem |
Kapitola |
T |
|
Taq-polymeráza |
7.4 Molekulárně genetické metody |
telofáze |
4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk |
terciární poměr pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
terminace replikace |
3.1 Replikace |
terminace translace |
3.3 Translace |
terminátor |
3.2 Transkripce |
Thermophilus aquaticus |
7.4 Molekulárně genetické metody |
thymin |
2.2 Nukleové kyseliny |
tolerantní reparace |
5.3 Reparační mechanismy |
transkripční faktory |
3.2 Transkripce |
transkripční jednotky |
3.2 Transkripce |
translační faktory |
3.3 Translace |
translokace nereciproké |
5.1 Klasifikace mutací |
translokace reciproké |
5.1 Klasifikace mutací |
translokace Robertsonské |
5.1 Klasifikace mutací |
trizomie |
5.1 Klasifikace mutací |
tRNA |
2.2 Nukleové kyseliny |
Turnerův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
Typ Abraxas |
Viz chromosomové určení pohlaví |
Typ Drosophila |
Viz chromosomové určení pohlaví;
Viz genové určení pohlaví |
Typ Habrobracon |
Viz chromosomové určení pohlaví;
Viz genové určení pohlaví |
Typ Lymantria |
Viz genové určení pohlaví |
U
Genetika - U
Pojem |
Kapitola |
U |
|
úpravy kotranslační |
3.3 Translace |
úpravy posttranslační |
3.3 Translace |
uracyl |
2.2 Nukleové kyseliny |
Ústava České republiky |
8.3 Etické problémy |
ústřední dogma molekulární biologie |
3 Zpracování genetické informace |
UV záření |
5.2 Rozdělení mutagenů |
V
Genetika - V
Pojem |
Kapitola |
V |
|
vazba 3´-5´ fosfodiesterická |
2.2 Nukleové kyseliny |
vazba N-glykosidická |
2.2 Nukleové kyseliny |
vektor |
8.2 Molekulární medicína |
virus hepatitidy typu C |
7.4 Molekulárně genetické metody |
virus lidského papilomu |
7.4 Molekulárně genetické metody |
vitamin D rezistentní rachitida |
7.1 Genealogické vyšetření |
vrozená vývojová vada |
5.2 Rozdělení mutagenů |
W
Genetika - W
Pojem |
Kapitola |
W |
|
Weber-Cockayneov syndrom |
5.3 Reparační mechanismy |
Wolfův-Hirschhornův syndrom |
5.1 Klasifikace mutací |
X
Genetika - X
Pojem |
Kapitola |
X |
|
X – vázaná dominantní dědičnost |
7.1 Genealogické vyšetření |
X – vázaná recesivní dědičnost |
7.1 Genealogické vyšetření |
Xeroderma pigmentosum |
5.3 Reparační mechanismy |
Z
Genetika - Z
Pojem |
Kapitola |
Z |
|
Zákon č. 373/2011 Sb., o specifických zdravotních službách |
8.3 Etické problémy |
zesilovač transkripce |
3.4 Regulace genové exprexe |
zeslabovač transkripce |
3.4 Regulace genové exprexe |
zlom |
5.1 Klasifikace mutací |
znaky neúplně vázané na pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
znaky pohlavně ovládané |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
znaky úplně vázané na pohlaví |
4.5 Genetická informace a pohlaví |
zpětná transkripce |
3.2 Transkripce |
životní cyklus buňky |
4. Vztah genetické informace k rozmnožování |