Genetika
7.2 Cytologická analýza
Cytologická analýza se využívá v cytogenetice. S pomocí optického (a někdy i fluorescenčního) mikroskopu se hodnotí počet chromosomů, jejich struktura a anomálie (obrázek 8).Chromosomy jsou pod světelným mikroskopem pozorovatelné pouze ve spiralizovaném stavu, ve kterém se nacházejí během buněčného dělení – mitózy (viz kapitola 4.1 Mitóza a meióza eukaryontních buněk).Nejčastějšími vzorky pro cytogenetickou analýzu pacientů jsou leukocyty v periferní krvi a plodová voda (při prenatální diagnostice), avšak lze zpracovat i jiné typy tkání (tumory apod.). Buňky ze získané vzorky se pomnoží kultivací a zastaví se v první části buněčného dělení - metafázi. Dosáhne se to s použitím tzv. mitotických jedů (např. kolchicin), které blokují funkci dělícího aparátu buňky, takže chromosomy zůstávají spiralizovány v její ekvatoriální rovině.Působením kombinací různých barviv a enzymů dochází k narušení povrchu spiralizovaných chromosomů a ke vzniku obrazců (proužků, angl. bands). Počet a uspořádání těchto proužků je pro jednotlivé chromosomy charakteristické a pomáhá diagnostikovat anomálie a poškození chromosomů.
Základním zpracováním chromosomů je G-proužkování (využívá aplikaci trypsinu a Giemsova barviva. Kromě toho známe R-proužkování, při kterém je obrazec vzniklých proužků reverzní (jakoby fotografický negativ) vůči G-proužkování. Při C-proužkování jsou velmi dobře pozorovatelné centromery chromozomů. Q-proužkování využívá chiakridin a při NOR-proužkování se chromosomy vizualizují s pomocí AgNO3.
Techniky proužkovaný chromozomů HRT (z angl. high resolution techniques) využívají zastavení dělení buněk před metafází (tzv. prometafáze, na rozhraní profáze a metafáze). Proto jsou chromosomy méně spiralizované, jsou delší, jemnější a lze pozorovat více pruhů (cca 800).
Obrázek 8 - Princip cytologické analýzy
Na obrázku 8 můžeme vidět karyotyp normální ženy. Počet, tvar a velikost chromosomů jsou pro každý druh konstantní. V tabulkách 5 a 6 je uvedeno třídění lidských chromosomů.
Tabulka 5 Rozdělení lidských chromosomů
Charakteristika
|
Skupina chromosomů | ||||||
A |
B |
C |
D |
E |
F |
G | |
Autozomy |
1 - 3 |
4 – 5 |
6 – 12 |
13 – 15 |
16 – 18 |
19 – 20 |
21- 22 |
Gonozomy |
- |
- |
X |
- |
- |
- |
Y |
Počet u muže |
6 |
4 |
15 |
6 |
6 |
4 |
5 |
Počet u ženy |
6 |
4 |
16 |
6 |
6 |
4 |
4 |
Tabulka 6 Charakteristika chromosomů podle velikosti a polohy centromery
Skupina chromosomů |
Charakteristika |
A |
Velké metacentrické chromosomy (centromery víceméně uprostřed chromosomu, obě raménka chromosomu stejně dlouhé) |
B |
Velké submetacentrické chromosomy (centromery posunuta mimo střed chromosomu, vznik kratšího raménka „p“ a delšího raménka „q“) |
C |
Středně velké metacentrické chromosomy |
D |
Středně velké akrocentrické chromosomy (centromery poblíž konců chromosomů-telomer)
|
E |
Malé submetacentrické chromosomy |
F |
Malé metacentrické chromosomy |
G |
Malé akrocentrické chromosomy |
Uvedenými technikami je možné ověřit přítomnost chromosomálních i genomových mutací, o kterých bylo pojednáno v kapitole 5.1 Klasifikace mutací.