Genetika
6.1 Kvalitativní znaky v populaci
Na začátku této kapitoly musíme přiznat, že její název je tak trochu zavádějící, protože si na kvalitativních znacích vysvětlíme jevy v populační genetice. Představme si situaci, že máme gen na autozomu, který má v populaci dvě varianty - alely. Označíme je: A pro dominantní alelu, a pro recesivní alelu. Předpokládejme, že můžeme odlišit heterozygota Aa od dominantního homozygota AA (je jedno, jestli fenotypově nebo laboratorním vyšetřením, jako např. v případě krevních skupin). Dále předpokládejme, že populace je panmiktická.
Pokud sledujeme četnost (frekvenci) alel v gametách, z nichž vzniká nová generace, zjistíme, že panmiktické populace mají tendenci dosáhnout určitý rovnovážný stav. Platí, že ve velké panmiktické populaci (také u člověka) se genové a genotypové frekvence z generace na generaci nemění a zůstávají konstantní. Názorně to ukazuje tabulka 4. Genové četnosti sledovaných alel v gametách označíme symboly p pro dominantní alelu A a q pro recesivní alelu a. Genotypové četnosti jsou tvořeny součinem genových četností. Splynutím gamet opačného pohlaví s alelami A vznikají v generaci potomků dominantní homozygoty AA, přičemž pro jejich početnosti platí: p · p = p2. Obdobně vznikají recesivní homozygoti aa: q · q = q2. Pokud splynou gamety, které obsahují různé alely, vzniknou heterozygoti, kteří statisticky tvoří polovinu kombinačních možností populace: (p · q) + (p · q) = 2pq (tabulka 4).
Tabulka 4 Alelové a genotypové četnosti v populaci
Četnosti:
|
A
p |
a
q |
A
p
|
AA
p2
D |
Aa
pq
H |
a
q
|
Aa
pq
H |
aa
q2
R |
Legenda: modrá barva – četnosti alel (genové) v gametách, červená barva – genotypové četnosti další generace, žlutá barva označení absolutních četností: D – dominantní homozygoti, H – heterozygoti, R – recesivní homozygoti.
Dostáváme rovnici, která se podle svých tvůrců nazývá Hardy-Weinbergova rovnovážná rovnice panmiktické populace:
(p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1 (1)
Genové (alelové) frekvence:
p – frekvence dominantní alely A v populaci
q – frekvence recesivní alely a v populaci
Genotypové frekvence:
p2 – frekvence dominantních homozygotů AA v populaci
2pq – frekvence heterozygotů Aa v populaci
q2 – frekvence recesivních homozygotů aa v populaci
Tato rovnice je matematickým vyjádřením rovnovážného stavu panmiktických populací. Je logické (podle tabulky 4), že genové frekvence p a q dostaneme odmocněním frekvencí genotypových p2 a q2.
Oba sledované parametry (genové i genotypové) se mohou udávat v relativních četnostech (jejich součet je roven 1) nebo v absolutních četnostech, které udávají celkový počet jedinců N. Jak můžeme vidět, Hardy-Weinbergova rovnice pracuje s relativními četností, protože jejich součet je roven 1. Absolutní četnosti genotypů jsou označeny v tabulce 4 symboly D pro dominantní homozygoty, H pro heterozygoty a R pro recesivní homozygoty. Jejich součet je roven celkovému počtu jedinců N:
D + H + R = N (2)
Absolutní genové frekvence můžeme získat, pokud si uvědomíme, že alely se vyskytují ve dvou kopiích u homozygotů a v jedné kopii u heterozygotů. Proto frekvenci dominantní alely A a recesivní alely a vypočítáme podle vztahů:
p = (2D + H)/2N (3)
q = (2R + H)/2N (4)
V jmenovateli je dvojnásobek počtu všech jedinců populace, protože každý jedinec obsahuje dvě alely pro sledován gen (viz. diploidní stav, kapitola 4).
Ne každá populace je vzhledem k sledovaným genům v genetické rovnováze. Jinými slovy, pokud zjistíme genové (alelové) frekvence a dosadíme je do vztahu (1), dostaneme podle uvedeného vzorce jiné četnosti genotypů, než jaké v skutečnosti najdeme v populaci. V takovém případě říkáme, že teoreticky očekávané četnosti genotypů se liší od zjištěných četností, které jsme zjistili přímým vyšetřením populace. Existuje několik faktorů, které významným způsobem mohou narušovat genetickou rovnováhu v populaci. Jsou to: mutace, migrace, selekce a genetický drift.
Mutace mohou měnit genetické parametry populace v případě, že nejsou letální a není výrazně ovlivněna reprodukční schopnost jednotlivců (tzv. fitness), kteří je obsahují ve svém genotypu.
Selekce může výrazně ovlivnit genetickou strukturu populace tehdy, pokud se vytváří selekční tlak vůči některému z genotypů. Platí, že nevýhodnost alely pro jednotlivce (např. v recesivním stavu) ještě nemusí znamenat její nevýhodnost pro celou populaci (viz příklad srpkovité anémie, kapitola 5.1, příklad 2).
Migrace významně ovlivňuje genetickou strukturu populace tehdy, pokud je intenzivnější výměna jedinců (z hlediska genetiky "genotypů") mezi populacemi s různou frekvencí alel sledovaných genů. Migrační procesy se přirozeně rozdělují na emigraci a imigraci.
Posledním faktorem vlivu je tzv. genetický drift, vlivem kterého dochází k náhodným posunům ve frekvenci jednotlivých alel sledovaných genů v populaci. Lze jej pozorovat např. při málopočetných populacích, nebo velkých populacích, rozdělených do menších subpopulací (např. geografickou izolací - vysoké pohoří, vzdálené ostrovy apod.) nebo nestejnoměrnou proporcionalitou zastoupení obou pohlaví v populaci. Právě zde zdůrazňujeme význam pojmu efektivní velikost populace, který v užším slova smyslu bere v úvahu i jiné důležité parametry kromě celkové četnosti jedinců.
Výše uvedené teoretické poznatky si nyní prakticky vysvětlíme na příkladu faktoru V Leiden. Faktor V (proakcelerin) je protein koagulační dráhy, který má důležitou roli v procesech hemostázy a při formování krevní sraženiny. Gen F5, který ho kóduje, se nachází na delším raménku chromosomu č. 1, lokace 1q23. Faktor V se produkuje hlavně v játrech, přičemž v krvi cirkuluje v neaktivní formě. K jeho aktivaci dochází např. při poškození cévy, kdy působením koagulačního faktoru Xa se aktivuje na aktivní faktor Va. V dalším sledu se může vlivem těchto faktorů konvertovat neaktivní protrombin na aktivní trombin, který spouští tvorbu fibrinu, důležitou při formování krevní sraženiny.
Autozomálně dominantní mutace v nukleotidové sekvenci genu v pozici 1691 má za následek záměnu bází, konkrétně G→A. V důsledku toho dochází k substituci původní aminokyseliny argininu v pozici polypeptidového řetězce č. 506 za aminokyselinu glutamin. V důsledku toho se stává aktivní faktor V rezistentní na aktivovaný protein C (APC), jehož úkolem je mimo jiné regulovat míru celkové aktivity faktoru FV tím, že ho inaktivuje štěpením na přesně určeném místě. Uvedená mutace (nazvaná podle města svého objevu v roce 1994 jako Leidenská) však záměnou aminokyselin toto štěpení znemožní, čímž se snižuje míra kontroly FV s pomocí APC. Proto proces tvorby sraženiny trvá déle, než je potřeba. Kromě toho se zvyšuje riziko tvorby abnormálních krevních sraženin. Mluvíme proto o tzv. hyperkoagulabilních stavech. Proto je tento parametr z hlediska hematologů velmi důležitý, protože v případě kardiovaskulárních příhod lze laboratorně určit, zda pacient má Leidenskou mutaci (příp. i důležité mutace jiných koagulačních faktorů) nebo ne. Tím se může upřesnit vliv vnějších faktorů na vznik onemocnění (stres, kouření, etylismus, orální kontraceptiva apod.) a s ohledem na genetickou konstituci pacienta se zvolí nejoptimálnější strategie terapie.
Předpokládejme, že v rámci testování vyšetříme za dané časové období 2000 pacientů, z nichž 1500 bude homozygotů GG s oběma zdravými alelami (D), které obsahují v místě 1691 guanin. 450 jedinců bude heterozygotních (H) s genotypem GA, protože budou obsahovat jednu zdravou alelu a jednu mutantní alelu. Nakonec budeme mít 50 jedinců, kteří budou homozygotní (R) pro mutantní alelu AA. Naším úkolem je ověřit, zda v populaci existuje genetická rovnováha ve smyslu Hardy-Weinbergova zákona. V případě, že by genetická rovnováha přítomna nebyla, znamenalo by to přítomnost rušivých faktorů, jako např. selekce vůči nositelem mutantní alely, jejich nižší reproducibilita a pod.
Protože známe počty všech tří genotypů v populaci, můžeme si v prvním kroku vypočítat genové frekvence obou alel. Kvůli zjednodušení si je označme jako G pro standardní alelu a A pro mutantní alelu. Po dosazení do vztahů (3) a (4) dostáváme následující relativně genotypové četnosti obou alel:
pG = (2D + H)/2N = (2 · 1500 + 450)/4000 = 3450/4000 = 0,8625 (86,25%)
qA = (2R + H)/2N = (2 · 50 + 450)/4000 = 550/ 4000 = 0,1375 (13,75%)
D = 1500 (GG)
H = 450 (GA)
R = 50 (AA)
N = 2000 (GG + GA + AA)
Všimněte si, že máme sice 2000 pacientů, ale každý z nich obsahuje dvě alely pro sledovaný gen FV. Proto je celkový počet alel dvojnásobný vůči celkovému počtu jedinců, tj. činí 4000 alel. Absolutní četnost zdravé alely G představuje 3450, což odpovídá relativní četnosti 0,8625. Jinými slovy, z celkového počtu 4000 alel je 86,25% zdravých alel G, což v absolutních počtech činí 3450 alel. Z nich se 3000 nachází u homozygotů GG a 450 u heterozygotů GA. Relativní frekvence recesivní alely A činí 0,1375. Jinými slovy, ze 4000 alel je 13,75% recesivních alel A, což v absolutních číslech představuje 550 alel. Z nich se 100 vyskytuje u homozygotů AA a 450 u heterozygotů GA. Součet relativních frekvencí všech alel je roven jedné, jak to vyplývá z levé strany vztahu (1) : (0,8625 + 0,1375)2 = 1.
Poznámka: Uvedené číselné hodnoty genových frekvencí jsou v intervalu reálného numerického rozsahu, který lze zjistit vyšetřením jedinců kaukazoidní rasy ve střední Evropě.
V druhém kroku si na základě získaných genových frekvencí ověříme, zda v populaci pacientů existuje genetická rovnováha, při které se genové i genotypové početnosti z generace na generaci nemění. Po dosazení do vztahu (1) dostáváme následující relativně genotypové frekvence:
p2 + 2pq + q2 = 1
↓
(0,8625)2 + 2(0,8625 · 0,1375) + (0,1375)2 = 1
↓
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
Zjistili jsme, že relativní frekvence zdravých homozygotů GG představuje 74,4%, heterozygoti GA s jednou mutantních Leidendskou alelou jsou zastoupeni v 23,7% a recesivních homozygotů AA s oběma mutantními alelami je pouze 1,9% z celkového počtu. Všimněte si prosím, že součet relativních četností ve třetím řádku výpočtu se opravdu rovná jedné a součet procentuálního zastoupení všech alel je rovný 100%.
Teoreticky očekávané absolutní genotypové četnosti, které by měly být přítomny v testované populaci v případě genetické rovnováhy, získáme tak, že relativně genotypové četnosti, získané podle vztahu (1) vynásobíme celkovým počtem jedinců N (2000 pacientů):
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
↓ x 2000
1488 + 474 + 38 = 2000 Teoreticky očekávané genotypové četnosti
↕ ?? – testování shody s pomocí statistických testů
1500 + 450 + 50 = 2000 Zjištěné reálné genotypové četnosti
D + H + R = N
Vidíme, že ačkoliv se číselné hodnoty očekávaných i pozorovaných genotypových četností pro sledovaný gen F5 přesně neshodují, jsou vzájemně pro jednotlivé genotypy podobné. Na základě toho můžeme konstatovat, že námi vyšetřena populace pacientů je pro sledován gen F5 v genetické rovnováze. Jinými slovy, neexistují významné rušivé vlivy typu mutací, selekce nebo migrace, které by genetickou rovnováhu v populaci narušovaly.
Poznámka: Existují statistické testy, kterými můžeme exaktně testovat rozdíly mezi očekávanými a pozorovanými četností a jejich statistickou významnost. V tomto případě lze použít např. chí-kvadrátový test (pouze pro úplnost informace: hladina významnosti výsledku tohoto statistického testu pro výše uvedený případ činí p = 0,07 při dvou stupních volnosti). Uvedené poznatky však přesahují rozsah a určení této studijní opory, proto se jim nebudeme věnovat. Bližší informace lze získat v příslušných učebnicích biostatistiky.
Poslední, ale zásadní otázka, kterou si můžeme položit, zní: V jakém případě by genetická přítomnost rovná nebyla? Při vysvětlení odpovědi na ni si pomůžeme předešlým příkladem. Pokud si pozorně spočítáme počet zdravých alel G a mutantních alel A v předchozím příkladu u očekávaných genotypových frekvencí (červeně) a také u pozorovaných frekvencí (černá barva), budou v obou případech stejné. Zjistíme 3450 zdravých alel G a 550 mutantních alel A. Jinými slovy, genové frekvence jsou stejné, ale drobné změny byly v genotypových frekvencích.
Nyní si představme hypotetickou (v reálném světě málo pravděpodobnou) situaci, že bychom v jiné skupině pacientů zjistili přítomnost 1725 homozygotů GG a 275 homozygotů AA. Nezjistili bychom ani jediného heterozygota GA. Vtip je v tom, že genové frekvence má tato hypotetická skupina shodné z předchozí reálnou populací pacientů, ovšem genotypové frekvence jsou zcela odlišné. I bez použití statistických testů můžeme vidět, že v tomto případě není přítomna genetická rovnováha. Skupina pacientů se velmi výrazně liší v genotypových frekvencích od očekávaných hodnot:
D = 1725 (GG)
H = (GA)
R = 275 (AA)
N = 2000 (GG + AA)
Genové frekvence:
pG = (2D + H)/2N = (2 · 1725 + 0)/4000 = 3450/4000 = 0,8625 (86,25%)
qA = (2R + H)/2N = (2 · 275 + 0)/4000 = 550/ 4000 = 0,1375 (13,75%)
Ověření genetické rovnováhy:
p2 + 2pq + q2 = 1
↓ ↓
(0,8625)2 + 2(0,8625 · 0,1375) + (0,1375)2 = 1
↓
0,744 + 0,237 + 0,019 = 1
↓ x 2000
1488 + 474 + 38 = 2000 Teoreticky očekávané genotypové četnosti
↕
1725 + + 275 = 2000 Zjištěné genotypové četnosti v druhé skupině pacientů
Na závěr této kapitoly si zopakujme nejdůležitější aspekty sledování kvalitativních znaků v populaci:
· Důležitým předpokladem genetické stability populace je panmixe a nepřítomnost procesů, které ji narušují (migrace, mutace, selekce).
· Při splnění výše uvedených předpokladů má alogamická populace tendenci stabilizovat genové a genotypové četnosti z generace na generaci.
· Tato stabilita je matematicky vyjádřena rovnicí, nazývanou Hardy-Weinbergův zákon.
· Platnost Hardy-Weinbergova zákona pro konkrétní sledovanou populaci se ověřuje s pomocí statistických testů (např. chí-kvadrátovým testem). Podle číselné hodnoty hladiny významnosti výsledku těchto testů (označovanou zkratkou "p") lze posoudit rozdíl mezi pozorovanými četnostmi a teoreticky očekávanými četnostmi genotypů.
· Teoreticky očekávané genotypové četnosti získáme dosazením zjištěných genových četností do Hardy-Weinbergova vztahu.
· V případě, že v populaci platí Hardy-Weinbergův zákon (čili v populaci je genetická rovnováha pro sledovaný gen), lze odmocněním genotypových frekvencí p2 a q2 získat genové frekvence p a q. Pokud ovšem v populaci genetická rovnováha není, výše uvedeným způsobem se relativní genové frekvence odvodit nedají resp. odmocněním uvedených číselných hodnot dospějeme k nesprávnému výsledku.
· Pro posouzení, zda je populace v genetické rovnováze může pomoci vztah:
H/√(D ∙ R) = 2 (5)
Čím výraznější je rozdíl výsledku od čísla 2, tím více se populace odchyluje od rovnovážného stavu pro sledovaný gen.
· Hardy-Weinbergův zákon platí i v případě většího počtu alel sledovaného genu. Např. pro krevně-skupinový systém ABO (viz tabulka 2, kapitola 4.3) platí rovnice, rozšířená o genové a genotypové frekvence třetí alely:
(p + q + r)2 = p2 + 2pq + q2 + 2pr + r2 + 2qr = 1
Relativní genové četnosti Alela
p IA
q IB
r i
Relativní genotypové četnosti Genotyp Fenotyp:
p2 IAIA A
2pq IAIB AB
q2 IBIB B
2pr IAi A
r2 ii
2qr IBi B