Mikrobiologie a imunologie
5 Základy a principy vyšetřovacích metod v mikrobiologii
5 Základy a principy vyšetřovacích metod v mikrobiologii
5.3 Testovací otázky
Diagnostika v lékařské mikrobiologii je zaměřena na stanovení etiologie a potvrzení příslušné diagnózy.
Správný diagnostický závěr mikrobiologického vyšetření a zahájení včasné terapie antibiotiky lze provést pouze v případě správného odběru biologického materiálu a vhodně zvolených vyšetřovacích metod.
K základním vyšetřovacím metodám patří přímá diagnostika – mikroskopický průkaz, kultivace, biochemický průkaz, stanovení citlivosti k antibiotikům a metoda PCR (polymerázová řetězová reakce).
Mikroskopický průkaz bakterií se provádí imerzním objektivem mikroskopu.
U některých typů bakterií, např. spirochét (treponemy, borrelie) se provádí pozorování v temném poli neboli v zástinu. Fluorescenční mikroskop slouží k diagnostice zejména u sérologických reakcí ve virologii stejně tak elektronový mikroskop.
Pro mikroskopickou diagnostiku je velmi důležitá příprava preparátů Nejjednodušší metodou je příprava nativního preparátu – mikrobiální suspenzi vytvoříme smícháním infekčního agens s fyziologickým roztokem (v parazitologii – např. Trichomonas vaginalis, v mykologii – např. kvasinky). Preparát se připravuje na podložní sklíčko, u nativních preparátů se kryje krycím sklíčkem, ostatní preparáty barvíme různými barvícími technikami.
K základnímu barvení v bakteriologii patří barvení podle Grama. Výsledkem barvení jsou grampozitivní (tmavěmodré - tmavěfialové)) a gramnegativní (růžově fialové) bakterie. V diagnostice má identifikace bakterií velký význam zejména pro zahájení včasné a správné antibiotické terapie.
Nejvirulentnější jsou bakterie v opouzdřeném stádiu růstu, protože pouzdro jim zajišťuje ochranu před antibiotiky, dezinfekcí i samotným imunitním systémem člověka. Pouzdra jsou velmi dobře patrná pod mikroskopem po obarvení Burriho metodou, např. u Streptococcus pneumoniae nebo Klebsiella pneumoniae.
Barvení podle Ziehl-Neelsena nám umožňuje zobrazit a odlišit acidorezistentní tyčky mykobakterií (zelené pozadí a ostatní elementy a růžová mykobakteria ve svazečcích).
Další barvící techniky využívají pro pozorování ve fluorescenčním mikroskopu barviva, např. fluorescein (žlutozelený), auramin (zlatožlutý) nebo rhodamin (červený).
V parazitologii se využívá barvení podle Giemsy - jádra parazitů mají karmínovou barvu, ostatní elementy jsou bleděmodré. Často však využíváme nativních preparátů.
Jedním z dalších kroků v diagnostice je kultivace v laboratorních podmínkách. Provádí se na kultivačních půdách se speciálním složením a v podmínkách velmi podobných prostředí lidského organizmu. Pro optimální růst bakterií je nutné zajistit dostatek vhodných živin, vlhkost, optimální pH, teplotu (optimální pro lidské patogeny je 37 °C), délka kultivace – 18-20 hodin, atmosféra (dle vztahu mikrobů ke kyslíku – aerobní a fakultativně anaerobní, anaerobní a mikroaerofilní).
Identifikace pomocí biochemických testů je založena na biochemické aktivitě jednotlivých druhů patogenů. Nejvíce aktivní jsou enterobakterie, dobře se identifikují biochemickými testy (např. štěpení glukózy, laktózy, manitolu, tvorba indolu, štěpení urey atd.).
Stanovení citlivosti k antibiotikům metodami kvalitativními i kvantitativními patří neodmyslitelně k základním diagnostickým postupům v lékařské mikrobiologii.
Kvalitativní testy – difuzní disková metoda patří k nejvíce používaným metodám stanovování citlivosti k antibiotikům. Metoda není vhodná pro použití u klinicky závažných stavů (meningitíd, sepsí, endokarditíd, u stavů se sníženou imunitní schopností – AIDS, transplantace, neoplastické procesy, popáleniny).
Kvantitativní testy - se využívají ke stanovování citlivosti k antibiotikům v tělních tekutinách u závažných stavů. Pomocí tzv. dilučních metod je možné stanovit MIC (minimální inhibiční koncentrace) a MBC (minimální baktericidní koncentrace).
MIC (minimální inhibiční koncentrace) je taková koncentrace antibiotika, která zastaví růst a množení mikroorganizmů.
MBC (minimální baktericidní koncentrace) je taková koncentrace antibiotika nebo chemoterapeutika, která přímo usmrtí mikroorganizmy.
Kvantitavními testy stanovujeme citlivost k antibiotikům u všech mikroorganismů izolovaných z tělních tekutin - plazma, likvor, moč. Provedení těchto metod musí probíhat ve sterilních podmínkách za přísného dodržování předepsaných standardů.
Výsledek tohoto vyšetření slouží především k zahájení cílené terapie antibiotiky ve správných dávkách a dostatečně dlouhou dobu.
Nepřímá diagnostická metoda – aglutinace pro průkaz přítomných antigenů u mikroorganizmů. Vhodná je zejména při identifikaci salmonel nebo escherichií.
Molekulárně – genetické metody (PCR) patří v posledních letech k nejmodernějším i nejrychlejším metodám v mikrobiologické diagnostice. Polymerázovou řetězovou reakcí se detekuje DNA mikroorganizmů, což je velmi přesné.
Nepřímá diagnostika se provádí sérologickými metodami – stanovení přítomnosti protilátek v séru pacienta, příp. detekce přítomného antigenu příslušného patogena.
Organizmus reaguje vždy na vniknutí cizorodého antigenu imunitní reakcí – vždy nejdříve nespecifickou imunitní reakcí a posléze specifickou imunitní reakcí (tvorbou protilátek, tzv. imunoglobulinů).
Sérologickou reakci lze využít k detekci antigenu nebo protilátek.
Základní metodou je aglutinace nepřímá nebo přímá a hemaglutinačně inhibiční test (antigen je navázán na erytrocyty). Výsledkem této reakce je komplex antigen - protilátka, který je viditelný pouhým okem jako sraženina.
Imunodifuze je metoda, která se používá k vzájemné reakci solubilního (rozpustného) antigenu s protilátkou. Reakce je viditelná na agaru jako precipitační linie.
Komplement – fixační reakce (vazba komplementu) se používá k detekci protilátek u akutní fáze infekčního onemocnění. Podstatou je vazba komplementu na komplex antigen – protilátka.
Imunofluorescence je metoda sloužící ke stanovení antigenu nebo protilátek značených fluorescenčním barvivem, např. fluoresceinem (žlutozelený), auraminem (zlatožlutý) nebo rhodaminem (červený).
RIA – Radioimmuneassay využívá ke kvantitativnímu stanovení např. hormonů, imunoglobulinů a léků. Antigeny jsou obvykle značené radioaktivním jodem.
ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay (enzymová imunoanalýza) metoda, která využívá k detekci protilátek nebo antigenů značení enzymy.
Literatura:
Kingsbury, D.T., Wagner, G.E. Microbiology. 1. vydání. Philadelphia: Harwal Publishing, 1991. ISBN 0-68-06234-4.
Votava, M. a kolektiv. Lékařská mikrobiologie speciální. 1. vydání. Brno: Neptun, 2003. ISBN 80-902896-6-5.